МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 5, с. 834-841
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.113.3
2'-ФТОРНУКЛЕОЗИДТРИФОСФАТЫ КАК СУБСТРАТЫ ВИРУСНЫХ РЕПЛИКАТИВНЫХ НУКЛЕОТИДПОЛИМЕРАЗ
© 2014 г. М. К. Куханова1*, А. Н. Коровина1, Ю. А. Шаркин2, А. В. Ажаев2, С. Н. Кочетков1
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва 119991
2East Finland University, Kuopio 70211, Finland Поступила в редакцию 14.05.2014 г. Принята к печати 19.05.2014 г.
Проведено сравнительное изучение субстратной специфичности трех вирусных репликативных поли-мераз разного происхождения (обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека, РНК-по-лимераза вируса гепатита С, ДНК-полимераза вируса простого герпеса) в отношении 2'-фторнуклео-зидтрифосфатов (2'F-NTP). В качестве матриц использованы: активированная ДНК, полиA-олигоU6 и (2'F-A)20-олигоU6 комплексы. Показано, что все полимеразы могут включать 2'F-NМP остатки в 3'-конец праймера, причем ДНК-полимераза вируса герпеса и обратная транскриптаза ВИЧ элонги-руют праймер с участием как природных dNTP, так и 2'F-NTP субстратов. Гомополимер 2'-фтораде-нозина (2'F-A)20 может служить матрицей для полимеризации как UTP, так и 2'F-UTP при катализе РНК-полимеразой вируса гепатита С, хотя эффективность синтеза существенно ниже по сравнению с природной матрицей. Показано, что катализируемая обратной транскриптазой ВИЧ реакция пирофосфо-ролиза остатка 2'F-CMP, находящегося на 3'-конце праймера, проходит на два порядка менее эффективно, чем природного остатка dNMP.
Ключевые слова: фторпроизводные нуклеотидов, вирусы, ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, пиро-фосфоролиз.
2'FLUORO DERIVATIVES OF NUCLEOSIDES AS SUBSTRATES OF VIRAL REPLICATIVE NUCLEOTIDE POLYMERASES, by M. K. Kukhanova1*, A. N. Korovina1, Yu. A. Sharkin2, A. V. Azhayev2, S. N. Kochetkov1 (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow 119991 Russia, *e-mail: Kukhan86@hotmail.com; 2East Finland University, Kuopio 70211, Finland). Substrate specificities of three viral replicative polymerases of different origins (HIV reverse transcriptase, hepatitis C virus RNA polymerase, and herpes virus DNA polymerase) towards 2'F-NTP were studied. Activated DNA, polyA-oligoU6 and (2'F-A)20-oligoU6 complexes were used as templates. It was shown that all DNA polymerases studied can incorporate 2'F-NMP into the 3'-end of primer-template complexes. HIV reverse transcriptase and herpes virus DNA polymerase can elongate synthesis with both dNTP and 2'F-NTP. Homopolymer (2'F-A)20 can serve as a template for polymerization of both UTP and 2'F-UTP, catalyzed by hepatitis C virus polymerase although with efficacy about 5 to 10-fold lower in comparison with natural primer-template complex. Pyrophosphorolysis reaction of 2'F-CMP residue at 3'-end of primer catalyzed with HIV reverse transcriptase is going by two orders of magnitude less effective if compared with natural dNMP residue at the same system.
Keywords: 2'fluoro-nucleotides, viruses, DNA polymerases, RNA polymerases, pyrophosphorolysis.
Б01: 10.7868/80026898414050085
Фторированные по различным положениям нуклеозиды в настоящее время широко используются для лечения вирусных инфекций и онкологических заболеваний [1—4]. Хорошо известным противораковым препаратом считается 5-фтору-рацил, который более 60 лет используется для лечения злокачественных опухолей, включая кар-
* Эл. почта: Kukhan86@hotmail.com
циномы и саркомы различной локализации. При лечении рака поджелудочной железы, бронхов, миелоидного лейкоза и других онкологических заболеваний применяются 2',2'-дифторцитидин (гемцитидин) и 2-фтораденозин-5'-фосфат (флу-дара, F-araA) [2, 5]. В терапии ВИЧ-инфекции широко используется 5-фторламивудин (FTC,
эмтрицитабин®), отличающийся от "родительского" ламивудина® (3ТС) пониженной токсичностью [6]. В нескольких работах описаны 2'-фтор-Р-В-арабинонуклеозиды, обладающие активностью против вирусов гепатита В, ВИЧ и герпеса [1, 7, 8]. Широкая биологическая активность 2'-фторнуклеозидов связана с тем, что они по физико-химическим свойствам близки как ри-бонуклеозидам, так и дезоксинуклеозидам. Действительно, с одной стороны, размер атома фтора сравним с атомом водорода, так что его введение в дезоксирибозный остаток мало сказывается на конформации соединения. С другой стороны, атом фтора — элемент с самым высоким электроотрицательным потенциалом, что определяет преимущественно С(3')-еяа0-конформацию углеводного остатка 2'-фторнуклеозидов, характерную для природных рибопроизводных [9—11]. Длина связи С—Б (1.35 А) близка к длине связи С—О (1.43 А) в 2'-положении рибозного остатка, а также аналогично С-О остатку атом фтора является акцептором водорода. Преимуществом атома фтора в рибозном остатке по сравнению с дез-оксирибозным остатком является тот факт, что сила связи С-Б превышает силу связи С-Н, что часто увеличивает химическую и биологическую стабильности фторсодержащих соединений [12].
Механизм антивирусной активности 2'-фтор-нуклеозидов подобен таковому для других антивирусных и противораковых нуклеозидных аналогов и заключается в их фосфорилировании клеточными киназами до соответствующих трифосфатов с последующим взаимодействием с вирусными ре-пликативными ДНК- или РНК-полимеразами и включением их в растущую цепь нуклеиновой кислоты. Показано, что 2Т-цитидин (2'Б-С) подавляет репликацию вируса гепатита С (ВГС) в системе репликона, а его трифосфат служит субстратом РНК-полимеразы ВГС и включается в 3'-ко-нец праймер-матричного комплекса. В тоже время 2'Б-С не подавлял репликацию вируса диареи крупного рогатого скота, суррогатной модели ВГС, а 2'-фторурацил (2Т-и) вообще не влиял на репликацию обоих вирусов [7, 13].
Ричардсон и др. [14] исследовали 2'Б-нуклео-зидтрифосфаты (2Т-МГР) в качестве субстратов ДНК-полимераз млекопитающих и показали, что эукариотические ДНК-полимеразы альфа и гамма способны включать 2Т-МГР (за исключением 2Т-АТР) в цепь ДНК и элонгировать ее до образования полноразмерных транскриптов, хотя значения константы Михаэлиса (Кт) для 2'-фторпроиз-водных в 20 раз выше по сравнению с природными нуклеотидами. Следует отметить, что праймаза ДНК-полимеразы альфа не "работает" ни на одном из этих фторпроизводных. Включение 2Т-МГР в цепь ДНК эукариотическими
ДНК-полимеразами может быть причиной токсичности этих соединений [14].
В данной работе нами показано, что 2Т-МГР служат субстратами и включаются в цепь поли-нуклеотидов тремя вирусными нуклеотидполи-меразами разного происхождения: обратной транскриптазой вируса иммунодефицита человека (ОТ ВИЧ), РНК-полимеразой вируса гепатита С (NS5B), ДНК-полимеразой вируса простого герпеса типа 1 (ВПГ-1), а также терминальной эу-кариотической нуклеотидилтрансферазой из тимуса теленка (ТёТ). Кроме того, выявлено, что фторированный гомополимер (2'Б-А)20 может служить матрицей при полимеризации как иТР, так и 2Т-иТР при катализе РНК-полимеразой ВГС, хотя эффективность синтеза существенно ниже по сравнению с природной матрицей. Показано, что катализируемая ОТ ВИЧ реакция пи-рофосфоролиза остатка 2'Б-СМР на 3'-конце праймера проходит на два порядка менее эффективно по сравнению с природным 3'-концевым остатком dNMR
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Фермент ОТ ВИЧ-1 получен от "Washington Co" (США); ДНК-полимераза ВПГ-1 и РНК-по-лимераза ВГС (NS5B) выделены по методикам, описанным ранее [15, 16]. В работе использованы терминальная ДНК-полимераза из тимуса теленка фирмы "BoehringerMannhem" (Германия), Т4-по-линуклеотидкиназа фирмы "SibEnzyme" (Россия), природные олигонуклеотиды фирмы "Ли-тех" (Россия) и меченые нуклеотиды [a-32P]dATP, [a-32P]UTP и [y-32P]ATP производства "Радиоизотоп" (Россия). 2'F-NTP и (2'F-A)20 любезно предоставлены Университетом Восточной Финляндии (East Finland University, Kuopio). Олигонуклеотид-ный праймер 5'-CCGTCFATTCCTGTAGTCT-3' и олигои6 фосфорилировали по 5'-концу с помощью [y-32P]ATP и Т4-полинуклеотидкиназы по методике производителя и отжигали соответственно с матричным полинуклеотидом 3'-GGCAGTTAAGGA-CATCAGAGCTCGGAACTGATGCGATTGACC-5' и полиА. Очистку праймер-матричного комплекса от радиоактивной метки проводили на Spin-колон-ке G-25.
Препаративные количества праймер-матрич-ного комлекса с 2'F-CMP на З'-конце праймера получали в реакционной смеси объемом 30 мкл, которая содержала описанный выше праймер-матричный комплекс (50 нМ), буфер (40 мМ Трис-HCl, pH 7.8, 10 мМ MgCl2, 50 мМ KCl), 20 мкМ 2'F-CTP и ОТ ВИЧ-1 (1 ед.); инкубация длилась 30 мин при 37°C. Полноту реакции оценивали с помощью электрофореза в денатуриру-
[2'F-NTP], мкМ
Рис. 1. 2'-Фторпроизводные нуклеозидтрифосфатов как ингибиторы вирусных полимераз. Концентрационные зависимости подавления активности ОТ ВИЧ и ДНК-полимеразы ВПГ-1 по включению [a-32P]ATP в активированную ДНК в присутствии 2'F-ATP и активности РНК-полимеразы ВГС по включению [a-32P]UTP в комплекс полиА—олигоиб в присутствии 2'F-UTP. Условия реакций описаны в разделе "Экспериментальная часть".
ющем ПААГ. Комплекс очищали с использованием Spin-колонки G-25.
Для определения включения 2'F-NMP ДНК-по-лимеразой ВПГ-1 реакционная смесь (10 мкл) содержала [5'-32P]-меченый праймер-матричный комплекс (10 нМ), различные концентрации изучаемых соединений, фермент (1 ед.) и буфер: 20 мМ Hepes (pH 7.8), 60 мМ (NH4)2SO4, 6 мМ MgCl2 и 1 мМ DTT. Реакцию проводили при 37°C в течение 30 мин.
Для РНК-полимеразы ВГС в качестве матрицы использовали комплексы полиА—олигои6 или (2Т-А)20—олигои6. Реакционная смесь (20 мкл) содержала комплекс полиА—олигои6 (1 мкг), исследуемые соединения в различных концентрациях, фермент (2 ед.), UTP (2 мкМ), [a-32P]UTP (0.4 мкКи) и буфер (Трис-HCI, pH 7.5; 5 мМ MgCl2, 1 мМ DTT), 20 мкг/мл полиА и 5 мкг/мл олиго^. Реакцию проводили при 30°C в течение 20—30 мин. По этой же схеме определяли способность (2Т-А)20 служить матрицей при полимеризации как UTP, так и 2'F-UTP. Реакции останавливали добавлением 5 мкл 98%-го формамида, 20 мМ ЭДТА, красителей бромфенолового синего и ксиленцианола (0.5% каждого). Анализ продуктов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.