БИООРГАНИЧЕСКАЯ
Том 19 *
ХИМИЯ
№ 1 * 1993
УДК 577.322.5 : 543.422.25
© 1993 И. В. Масленников, А. С. Арсеньев, Л. Д. Чикин, А. Т. Кожин, В. Т. Иванов
20-1Н-ЯМР-ИСС ЛЕДОВ АННЕ КОНФОРМАЦИИ ТРАНСМЕМБРАННЫХ СЕГМЕНТОВ С, Е и С БАКТЕРИОРОДОПСИНА
Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина РАЛ, Москва
При помощи двумерной спектроскопии 'Н-ЯМР исследована конформация синтетических фрагментов С (остатки 67—106), Е (128—162) и О (190—233) бактериоопсина На1оЬасШЫт ИЫоЫит, солюбилизированных в смеси хлороформ — метанол (1 : 1) с 0,1 М 1ЛСЮ4. Полное отнесение сигналов в спектрах ЯМР проведено с использованием спектров 0(}Р-С03У, ТОС8У и 1\'ОЕ5У. В спектрах №ОЕ5У идентифицированы ядерные эффекты Оверхаузера между протонами. Определены амидные группы с замедленной скоростью обмена прогонов на дейтерий растворителя. Анализ полученных данных показал, что пептиды имеют конформации правых а-спиралей на участках 77—101 (сегмент С), 131 — 159 (Е) и 198—227 (С).
В состав бактериородопсина (В10 — белка пурпурной мембраны На1оЪас1егшт На1оЫит [1, 2] — входит одна полипептидная цепь из 248 остатков и ретинальный хромофор, связанный с остатком лизина-216 [3]. Реконструкция пространственной структуры по данным электронной криомикроскопии (ЭКМ) показала, что почти перпендикулярно плоскости мембраны расположены семь а-спиральных областей, которые соотнесены с аминокислотной последовательностью ВЯ [4 ], Однако достигнутого электронной микроскопией разрешения (3,5 А в плоскости параллельной поверхности мембраны и 10 А в направлении, перпендикулярном поверхности мембраны) недостаточно для выяснения тонких деталей пространственной структуры
Методы двумерной 'Н-ЯМР-спектроскопии эффективны для изучения пространственной структуры пептидов и небольших белков как в водном растворе, так и в условиях, имитирующих гидрофобную среду биологических мембран (мицеллы или органические растворители). Показано [5], что ВЯ, солюбилизи-рованный в смеси хлороформ — метанол, сохраняет вторичную структуру на-тивного белка в пурпурной мембране и обладает специфической третичной структурой. Более того, индивидуальные фрагменты ВИ, выделенные после расщепления полипептидной цепи, сохраняют в этой смеси органических растворителей конформацию, характерную для интактной молекулы Г5, 6].
Эти наблюдения позволяют предложить следующую схему «модульной сборки» пространственной структуры мембранных белков. Конформации а-спиральных фрагментов определяют независимо с помощью конформационного анализа на
Список сокращений: ВИ — бактериородопсин; sC, сегмент С— [№е68]бактериоопсин-(67—106)-полипептид; ¡Е, сегмент Е — [К'1е145 ] бактериоопсин- (128—162) -полипептид; сегмент С —
[М1е ] бактериоопсин- (190—233) -полипептид; 508 — додецилсульфат натрия; ЭКМ — электронная криомикроскопия; 21)-ЯМ1' — двумерный ЯМР; ЯЭО — ядерны,! эффект Оверхаузера; ООР-СОЗУ — корреляционная спектроскопия с двухквантовым фильтром; ТОСЗУ — тотальная корреляционная спектроскопия; Г^ОЕЗУ — спектроскопия ЯЭО.
I 87
■I
IjVW r,-
175 072
ОС
AÔ4 ••
oí
APÖ "J
it 91
0»\
« G7J 7 T90
, R(S2 w
Y 79 is
Ok
W86
8,8
D96 у, ,,
F 71
469
Föfl £75
Q IOS
•О О»
I'D 7(74
Ol
iß N75 0«
8,4
8,0
7,6
S ф-I
R 82
192 íd
3.2
FT,
М.Д.
3,6
4,0
4.4
4.8
Z 2 F2, M.Д.
б
4151
А13 9 К
л 1140,
1148
I
\
Л 57
8
У136 ЦТ/«
Rtf* 1
м. д.
\3,6
Ж159
G 755 UV/JÖ
W«, ^ L»»| I ^SJ$
w А74-4Л
F755 Vй7 kl6°
tt Л to « №S/J*
ГШ
4,4
К129
f F135 Y/J7
0«
4 Я
8.4
a, о
Рис. la,б
7,6
7,2 Г2,ПД,.
5
V2¡* V2,0
Щ 8
V2I7
.сгго
1_22*П>« GI92
1222 я 8
1229
\х209*л/ C95CJ97 »Г! I\ X »ÍL223 iL 'f y-
i207*?® It 1Ш
T205
К2'6Ш<-206 * L20J
CÍ92 /,928
SI 93
4,5
8,5 8,0 7,5 F2, м.д.
Рис. 1. ГШ/С"Н-область DQF — COSY-спектров [М1е68]бактериоопсин-(67—106)-полипептида («i - 7,10—8,90 м. д., а>г - 3,15—5,20 м. д.) (а), [№е|45)бактериоопсин-( 128—162)-полипептида («1-7,10—9,30 м. д., и>г - 3,20—4,70 м. д.) (б) и [ГЛе209]бактериоопсин-(190—233)-полипептида (íui - 7,05—8,90 м. д., Ш2 - 3,10—4,85 м. д.) (в), солюбилизированных в смеси хлороформ — метанол (1:1) с 0,1 М L1CIO4, при 30° С. Показано отнесение кросс-пиков N¡H/C?H
основе данных 20-ЯМР, а пространственную упаковку фрагментов осуществляют с использованием данных ЯМР и ЭПР (см., например, [6]) и ЭКМ о контактах между спиралями. Дополнительно к экспериментальным данным можно учесть стерические ограничения, критерии компактной упаковки, результаты минимизации конформационной энергии и некоторые априорные соображения.
К настоящему времени проведен первичный анализ данных ЯМР и охарактеризованы конформации протеолитических фрагментов ВР2 (остатки 163—231, соответствующие трансмембранным спиралям F и G) [7] и С2 (остатки 1—71, спирали А и В) [8], фрагмента А (остатки 1—36) [9], синтетических аналогов трансмембранных сегментов В (остатки 34—65) [10], D (102—136) [11] и G (205—231) [12], солюбилизированных в смеси хлороформ — метанол, а также фрагмента А (1—36) [9] и синтетического аналога сегмента В [13], встроенных в мицеллы додецилсульфата натрия. По данным 'Н-ЯМР-спектроскопии рассчитаны конформации трансмембранного сегмента В, солюбилизированного в смеси хлороформ — метанол [14] и встроенного в мицеллы SDS [15], фрагмента А в растворе и в мицеллах SDS [16] и протеолитического фрагмента ВР2, солюбилизированного в смеси хлороформ — метанол [17].
В настоящей работе проведено полное отнесение сигналов в спектрах 'Н-ЯМР синтетических трансмембранных сегментов С (в дальнейшем sC, остатки 67—106), Е (sE, 128—162) и G (sG, 190—233) бактериоопсина, солюбилизированных в смеси хлороформ — метанол (1:1) с 0,1 М LiC104. Наблюдаемые контакты ЯЭО и времена обмена амидных протонов NH на дейтерий растворителя определяют пространственную структуру пептидов как правые a-спирали на центральных
7 О
4-
75
Ф
■■■■□■■□■■шмм ■ неявнее
8 О 85 90 95 IDO IOS
TXVPFGGEQNPIVWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADQG
130
4-
□□с
135 140 145
ISO 155
160
■ь
TKVYSYRFVWWAISTAAXLVILYVLFFGFTSKAES
G
190 195 2 О О 205 210 215 220 225 230
LI03EGAGIVPLNIETLLFXVLDVSALVOFGLILLRSRAIFOEA
участках и более подвижные на N- и С-концах. Проведено сравнение определенных по данным 'Н-ЯМР-спектроскопии структур трансмембранных сегментов BR, в различных средах, моделирующих мембранное окружение (смесь хлороформ — метанол, мицеллы SDS) [7—17], с ЭКМ-структурой BR [4].
После растворения пептидов в смеси хлороформ — метанол и инкубации в течение 24 ч при комнатной температуре были получены 20-спектры, фрагменты которых приведены на рис. 1. Инкубация способствует достижению конформа-ционной однородности пептидов в растворе.
Для выделения спиновых систем протонов отдельных аминокислотных остатков использовали спектры DQF-COSY и TOCSY. Отнесение сигналов к определенному положению остатков в первичной структуре было выполнено посредством анализа daN(i, i+ 1)-, dgN(iy г+1)- и dm(i, г'+1)-связей ЯЭО между амидным протоном (i + 1)-го остатка и соответственно протонами СвН, 0®Н и NH предыдущего по аминокислотной последовательности г-го остатка [18 ]. Полное отнесение сигналов получено в основном при анализе d^N(i, i + 1)- и d^ti, i+ 1)-связей. Найденные ЯЭО-контакты суммированы на рис. 2, а химические сдвиги сигналов протонов сегментов С, Е и G представлены в табл. 1—3.
Трансмембранный сегмент С — [Nle6il]бактериоопсин-(б7—106)-полипептид
Наличие большого количества остатков лейцина, а также их локализация на коротком участке полипептидной цепи (на участке Рго-91 — Leu-100 семь остатков лейцина) сильно усложнили процедуру отнесения сигналов. d(i, ¿+1)-Связи чежду парами остатков Leu-94/Leu-95 и Ala-99/Leu-100 не идентифицированы лз-за перекрывания сигналов в спектрах. Отсутствуют d(i, ¿+1)-связи между парами остатков Рго-77/11е-78 и Gln-105/Gly-106. Из-за сильного перекрывания сигналов в СаН-области спектров NOESY выявлено лишь пять daN(i, ¿ + 3)- и две daN(i, / + 4)-связи (контакты ЯЭО между протонами СаН ¿-го и NH (¿ + 3)-или (г+ 4)-го остатков соответственно; рис. 2 С, табл. 1).
Анализ однозначно идентифицированных контактов ЯЭО позволяет сделать вывод о том, что структура sC близка к а-спиральной. По-видимому, а-спиральный участок начинается с остатка Рго-77 и заканчивается остатком Val-101. На этом участке не наблюдается каких-либо кросс-пиков, противоречащих конформации а-спирали. Замедленные скорости обмена амидных протонов NH остатков Тгр-30 — А1а-84 и Trp-86 — Val-101 на дейтерий растворителя (время полуобмена не менее 10 ч для остатков Arg-82 и Leu-92 и не менее 25 ч для остальных остатков этого участка) подтверждают наличие а-спирали начиная с СО-группы остатка Asn-76 и заканчивая NH-группой остатка Val-101. Исключение составляет протон NH остатка Asp-85, быстро обменивающийся с растворителем.
Трансмембранный сегмент Е— [Nle'i5]бактериоопсин-( 128—162)-полипептид
При использованных температурах не удалось идентифицировать d(i, i+ 1)-связи между остатками 128/129 и 161/162, что, по-видимому, вызвано большой подвижностью концевых остатков молекулы, а также между остатками 130/131 из-за перекрывания кросс-пиков.
Рис. 2. Аминокислотные последовательности синтетических аналогов сепментов С, Е и С бактериоопсипа и ¿-связи с участием протонов N11, С"Н и С®Н (СГНг-протоны остатков пролипа рассматривались как МЬпротоны). Использовано однобуквенпсе обозначение аминокислотных остатков, X — остаток норлейцина. Цифры соответствуют номеру остатка в аминокислотной последовательности 1Ш. Толщина линий, отвечающих ¿-связям, характеризует интенсивности (сильные, средние и слабые) соответствующих кросс-пиков в спек!рах ¡ЧОЕЗУ. Кружками отмечены ЯЭО-связи, присутствие которых в спектре вызывало сомнение. Остатки с замедленной и промежуточной скоростью обмена амидных протонов ИН на дейтерий отмечены соответственно черными и пустыми квадратами над аминокислотной последовательностью
Таблица 1
Химические сдвиги сигналов протонов (5 (±о,оц, м.д.) [М1е68]бактериоопс1ш-<67-106)-полипептида (сегмент с) в смеси хлороформ-метанол (1:1) с од М ЫС1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.