научная статья по теме АБЕРРАНТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ МИКРОРНК ПРИ РАЗВИТИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ТОЛСТОЙ КИШКИ Биология

Текст научной статьи на тему «АБЕРРАНТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ МИКРОРНК ПРИ РАЗВИТИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ТОЛСТОЙ КИШКИ»

ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 10, с. 1232-1244

ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА

УДК 575.1:575.224.29-616-006

АБЕРРАНТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ микроРНК ПРИ РАЗВИТИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ТОЛСТОЙ КИШКИ

© 2014 г. В. А. Тарасов1, Д. Г. Матишов1, Е. Ф. Шин1, Н. В. Бойко1, Н. Н. Тимошкина1, М. А. Махоткин1, А. М. Ломоносов2, А. А. Кирпий2, О. И. Кит3, А. Ю. Максимов3

1 Институт аридных зон Южного научного центра Российской академии наук, Ростов-на-Дону 344006

e-mail:johnnyeugenie@gmail.com, vat.vigg@mail.ru 2 ООО Интерлабсервис, Москва 115035 3 Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Минздрава России, Ростов-на-Дону 344037

Поступила в редакцию 23.01.2014 г.

С помощью параллельного множественного секвенирования нуклеотидной последовательности проведен сравнительный анализ экспрессии микроРНК в клетках опухолевой и нормальной ткани толстой кишки и выявлено 40 микроРНК, аберрантно экспрессирующихся при развитии рака. Обнаружено увеличение экспрессии для 15 микроРНК и уменьшение экспрессии для 25 микроРНК. Идентифицировано 16 кластеров микроРНК с координированной или неполностью координированной аберрантной экспрессией в клетках опухоли толстой кишки. В двух (miR-183/182, miR-106b/25) и четырех (miR-143/145, miR-497/195, miR-30e/30c-1, miR-30a/30c-2) кластерах наблюдалось статистически значимое координированное увеличение и уменьшение экспрессии соответственно для всех микроРНК, входящих в кластер. Выявлено три аберрантно экспрессирующихся микроРНК (miR-100-5p, miR-30d-5p, miR-204-5p), для которых, однако, ранее не была показана связь с развитием рака толстой кишки. Полученные в работе результаты указывают на возможность использования шести координированно экспрессирующихся кластеров микроРНК в качестве маркеров развития рака толстой кишки.

DOI: 10.7868/S0016675814080104

В основе развития и прогрессии злокачественных опухолей лежит микроэволюционный процесс клеточных клонов, обусловленный возникновением наследуемых изменений генома и последующим отбором. Развитие опухолей связывали с возникновением мутаций в определенных генах-супрессорах опухоли и онкогенах [1—3]. Однако результаты исследований последних десятилетий показали, что наряду с мутациями в прогрессии опухоли существенную роль играют эпигенетические изменения генома, связанные с метилированием ДНК и модификацией гистонов [4]. Установлено, что для злокачественных клеток характерным является снижение уровня общего метилирования ДНК, но дифференциальное увеличение метилирования промоторов генов-су-прессоров опухоли [5]. Процесс дифференциального метилирования ДНК и модификации гистонов может быть связан с действием микроРНК, участвующих в РНК-зависимом транскрипционном замолкании генов. Сейчас известно, что микроРНК, имеющие размер около 21—23 нук-леотидов, являются глобальными регуляторами генной активности, под прямым контролем которых находится не менее 60% генов человека. Функция микроРНК связана с распознаванием нуклеотидной последовательности в информаци-

онных РНК либо последовательности ДНК генов, при этом непосредственно подавление их экспрессии осуществляет полибелковый комплекс, ассоциированный с микроРНК, который получил название RISC. В клетках человека доминирующим процессом является посттранскрипционное замолкание генов, связанное с дестабилизацией иРНК и подавлением трансляции. Однако, как показано в ряде работ, в клетках человека, хотя и с меньшей эффективностью, чем в клетках растений, происходит и микроРНК-зависимое транскрипционное замолкание генов, связанное с дифференциальным метилированием промоторов генов и модификацией гистонов [6, 7]. Синтез микроРНК включает в себя несколько этапов. На первом этапе синтезируется первичная микроРНК (pri-microRNA), имеющая размер порядка тысячи нуклеотидов, которая в результате функционирования комплекса белков Drosha и DGCR8 преобразуется в микроРНК-предшественник (pre-microRNA). Заключительный этап созревания микроРНК осуществляется РНКазой DICER уже после перемещения пре-микроРНК из ядра в цитоплазму. В результате образуется двуцепочечная микроРНК. До недавнего времени считалось, что только одна из цепей этой двуцепочечной структуры является функци-

онально значимой, однако в последние несколько лет для ряда микроРНК показано существование функционально полноценных 3'- и 5'-форм одной и той же микроРНК [8]. Каждая индивидуальная микроРНК контролирует функцию нескольких десятков или даже сотен генов. И в этой связи аберрантная экспрессия микроРНК влияет на функцию целой группы генов. В результате наследуемые изменения экспрессии микроРНК имитируют эффекты макромутаций, которые могут лежать в основе существенных изменений свойств клетки, в частности, приводить к их злокачественной трансформации. Впервые на роль микроРНК в канцерогенезе указали факты по локализации генов-продуцентов микроРНК в участках генома, характеризующихся высокой частотой хромосомных перестроек, таких как де-леции, амплификации и транслокации, в клетках злокачественных опухолей человека [9].

В настоящее время роль аберрантной экспрессии микроРНК в контроле канцерогенеза на разных стадиях развития опухоли является очевидной, но спектр аберрантно экспрессирующихся микроРНК зависит от типа и стадии развития опухоли, он также меняется при переходе одного случая опухоли к другому. Поэтому остается не до конца понятным, в какой степени аберрантно экспрессирующиеся микроРНК отражают изменение метаболизма при злокачественной трансформации клеток, а в какой степени обуславливают эти изменения. Не до конца также ясна роль координированной экспрессии структурно сцепленных в кластер микроРНК в развитии злокачественных опухолей различной локализации. В этой связи нами исследован спектр аберрантно экспрессирующихся микроРНК в пяти случаях колоректального рака.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение образцов опухолевой и здоровой ткани толстой кишки. Для последующего выделения РНК, непосредственно после резекции опухоли толстой кишки, образцы нормальной и злокачественной тканей помещались в жидкий азот. Параллельно проводился забор ткани для гистологического анализа. В результате для всех исследованных 1

в работе пациентов были получены гистологические характеристики опухоли и подтвержден диагноз аденокарциномы толстой кишки.

Выделение и анализ РНК. Тотальную РНК выделяли модифицированным методом Хомчинского [10]. Количественный анализ тотальной РНК проводили на приборе Qubit (Life Science Technologies). Для качественного анализа тотальной РНК

1 Все участники эксперимента были полностью информированы и документально выразили свое согласие на участие в эксперименте.

проводили электрофорез в денатурирующем ага-розном геле с формальдегидом [11]. Для выделения фракции малых РНК использовали протокол mirVana miRNA Isolation Kit (Ambion, Life Science Technologies, США).

Подготовка библиотеки транскриптома микроРНК. Создание и последующую очистку библиотеки транскриптома микроРНК проводили с помощью набора TruSeq Small RNASample Preparation Kit (Illumina, США). К фракции малых РНК последовательно пришивали 3'- и 5'-адапте-ры, проводили обратную транскрипцию и амплификацию созданной конструкции микроРНК согласно прилагаемому протоколу. Копии кДНК очищали электрофорезом в 6% ПААГ. Экстракцию и конечное растворение кДНК из геля проводили водой, осаждение — гликогеном и 100%-ным этанолом. Для количественного определения кДНК использовали прибор Qubit (Life Science Technologies).

Параллельное множественное секвенирование. Множественное параллельное секвенирование нуклеотидных последовательностей кДНК-биб-лиотек проводили на приборе MiSeq (Illumina, США). Идентификация зрелых микроРНК проводилась с использованием программы MiSeq Reporter v. 2.2.

Статистический анализ. При проведении расчетов использовали компьютерный пакет edgeR [12]. В анализ включены микроРНК, представленные в выборках не менее 10 копиями, по крайней мере, в одном из исследованных вариантов. Для учета влияния интегральной экспрессии микроРНК на экспрессию сравниваемых микроРНК проводилась нормализация сравниваемых библиотек методом усеченного среднего М-значений (TMM), где М является логарифмом отношения частот встречаемости микроРНК в сравниваемых вариантах [13]. При расчете случайной вариации наблюдаемых значений частот учитывались два фактора: первый, связанный с размером регистрируемой выборки, подчиняющийся закону Пуассона, и второй, независимый от размера выборки, определяющий относительную ошибку измерений, равную 10% [14]. При оценке статической значимости различий использовали точный тест для негативного биноминального распределения, подобный точному тесту Фишера, предложенный Робинсоном и Смитом [15]. Для учета множественности сравнений использовали метод оценки вероятности появления ложнопозитивных результатов (FDR), развитый Бенджамини и Хохбергом [16].

Kоллекция тканей

X/ J \\

Пациенты

Тотальная PHK

1

H ¡Oi

Библиотеки кДHK копий Hi микроPHK

>5;

Случайная выборка молекул кДHK

\

Секвенирование всех кДHK копий выборки

\

Идентификация секвенированных ^HK копий

Частота микроPHK

1 ( t Г

'.нь Лн Л

Создание библиотеки кДHK OH

Тотальная PHK

З

OH

З' адаптер З' лигирование

S' адаптер З' адаптер

S' З'

(

Праймер

( )

Обратная транскрипция

Амплификация

Праймер

Индексирующая последовательность

Рис. 1. Использование множественного параллельного секвенирования для определения экспрессии микроРНК. а — этапы оценки дифференциальной экспрессии микроРНК, б — создание библиотеки кДНК (TruSeq(TM), Illumina). Обозначения: Н — норма, О — опухоль; цифрами 1—5 обозначены номера пациентов с колоректальным раком.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спектр аберрантно экспрессирующихся микроРНК

В работе был проведен анализ дифференциальной экспрессии микроРНК в клетках пяти гистологически охарактеризованных опухолей толстой кишки. При этом доля злокачественных клеток в исследованных образцах ткани составляла 70% в трех случаях, обозначенных нами как 2, 3 и 4-я опухоли, и 60 и 80% для опухолей 1 и 5 соответственно, включенных в анализ. Контролем служили клетки образцов нормал

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком