МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 78, № 2, с. 186-191
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.21.05
АДАПТАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA ЫРОЬУПСА К ЭТАНОЛУ
© 2009 г. Е. Н. Бирюкова1, А. Ю. Аринбасарова, А. Г. Меденцев
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 10.04.2008 г.
Изучена устойчивость дрожжей Yarrowia Пробка в условиях этанольного стресса в зависимости от концентрации этанола и времени воздействия. Показано повышение выживаемости клеток в вариантах их предобработки малыми дозами этанола, оксидантов и мягкого теплового воздействия. Изучение дыхательной активности клеток в условиях этанольного стресса выявило участие альтернативной цианидре-зистентной оксидазы в адаптивном ответе клеток. Установлено, что в ответ на воздействие этанола в клетках снижается уровень внутриклеточного цАМФ, что коррелирует с увеличением активности анти-оксидантных систем (каталазы, супероксиддисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионре-дуктазы), а также НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы.
Ключевые слова: дрожжи Yarrowia Иро1уйса, стресс, адаптация, этанол, дыхательная активность, ингибиторный анализ, альтернативная оксидаза, цАМФ, НАД+-зависимая алкогольдегидрогеназа.
Этанол является соединением, способным в высоких концентрациях подавлять физиологическую активность дрожжевых клеток [1-4].
Токсичность этанола связана с его способностью подавлять биосинтез макромолекул, денатурировать белки цитоплазмы, снижать активность гликолитических ферментов [2, 5-7], нарушать транспортные процессы ионов и метаболитов через плазматическую мембрану [5-7], изменять липид-ный состав мембран [4, 8-10]. Установлено, что первичное действие этанола обусловлено увеличением анионной и протонной проницаемости цито-плазматической мембраны, что сопровождается ее деэнергизацией (падение АрН и Em) [5-7, 11] и снижением внутриклеточного рН [11].
Ранее было показано [1, 2], что при воздействии на Saccharomyces cerevisiae субоптимальной температуры или этанола наблюдается появление мутантов с нарушенной дыхательной активностью. Действие указанных стрессоров может быть связано с нарушением митохондриальной цепи переноса электронов и, как следствие, увеличением образования активных форм кислорода (АФК), что приводит к окислительному повреждению белков, липи-дов и ДНК. Вопросы, связанные с влиянием стрессоров на дыхательную активность дрожжей, практически не изучены.
Цель данной работы заключалась в выявлении изменений в дыхательной цепи митохондрий, определении активности антиоксидантных ферментов, а также исследовании динамики цАМФ в процессе
1 Адресат для корреспондениции (e-mail: biryukovae05@ rambler.ru).
адаптации дрожжей Y. lipolytica к воздействию этанола в различных концентрациях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали дрожжи Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2378, полученные из ВКМ ИБФМ им. Т.К. Скрябина РАН. Дрожжи культивировали при 29°С в колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды Ридер [12] с глюкозой (1%), на качалке (200 об/мин). Биомассу дрожжей оценивали по оптической плотности культуры при длине волны 540 нм (Specol 21).
Стресс вызывали воздействием различных концентраций этанола на суспензии клеток экспоненциальной (10-12 ч) и стационарной (24 ч) фаз роста. Для этой цели клетки отмывали от среды стерильной дистилированной водой, ресуспендировали в 50 мМ трмс-фосфатном буфере (рН 7.0) и инкубировали в присутствии различных концентраций этанола.
Клетки адаптировали путем предобработки малыми дозами этанола (1%, 60 мин), оксидантов (0.5 мМ Н202, 60 мин), а также инкубации при 37°С в течение 60 мин.
Выживаемость клеток определяли путем их высева на сусло-агар. Учет колоний (КОЕ) осуществляли через 48-72 ч культивирования при 29°С.
Скорость потребления кислорода измеряли по-лярографически с помощью закрытого тефлоновой пленкой платинового электрода типа Кларка. Конечный объем пробы составлял 2 мл, температура измерений 20-22°С. Концентрацию кислорода, растворенного в среде, принимали равной 250 мкМ. Ак-
АДАПТАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ УАЯЯОША ЫРОЬУЛСА К ЭТАНОЛУ
187
Выживаемость, %
Рис. 1. Устойчивость У. Иро1уйса к различным концентрациям этанола: 1 - клетки из фазы экспоненциального роста; 2 - клетки из фазы стационарного роста.
тивность дыхания выражали в нмоль О2 мин-1 мг-1 сухих клеток.
Экстракцию цАМФ из клеток осуществляли хлорной кислотой (5%). Экстракт нейтрализовали 5 н КОН при интенсивном перемешивании. Осадок клеток удаляли центрифугированием при 15 000 g 60 мин. Экстракт хранили при -15°С. Определение цАМФ проводили по стандартной методике, используя набор фирмы "АтегеИат".
Клеточные экстракты для определения активности ферментов получали следующим образом. Клетки дважды промывали дистилированной водой и суспендировали в 50 мМ трис-фосфатном буфере (рН 7.0), содержащем 0.5 мМ фенилметилсульфо-нилфторид (ФМСФ) - ингибитор протеаз, после чего клетки разрушали на прессе Френча. Гомогенат центрифугировали при 105000 g в течение 60 минут. Осадок отбрасывали, а супернатант использовали для определения активности ферментов.
Активность антиоксидантных ферментов, су-пероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионредуктазы, определяли, как описано в предыдущей работе [12]. Активность НАД+-зависимой алкогольдегидроге-назы измеряли по восстановлению НАД+, £340 = = 6.22 мМ-1 см-1 [13].
Содержание белка определяли с использованием биуретового реактива.
Спектральные исследования проводили на спектрофотометре 8Ыта^и (Япония).
В работе использовали коммерческий препарат Н2О2, антимицин А и бензгидроксамовую кислоту (БГК) фирмы "Sigma".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 представлены данные по выживаемости У. Иро1уг1са, выращенных на глюкозе (1%), после воздействия различных концентраций этанола
Выживаемость, %
Время инкубации, мин
Рис. 2. Чувствительность У. Пробка из фазы экспоненциального роста к этанолу (15%) в зависимости от предобработки клеток малыми дозами спирта: 1 - без предобработки (контроль); 2 - предобработка этанолом (1%, 60 мин); 3 - предобработка этанолом (5%, 60 мин).
в течение 60 мин. Видно, что с увеличением концентрации спирта происходило заметное снижение жизнеспособности клеток из фазы экспоненциального роста (кривая 1). Летальная концентрация этанола составляла 15%. Клетки из стационарной фазы роста были более устойчивы к этанолу (кривая 2).
На рис. 2 видно, что предобработка клеток У. И-ро1уйса из экспоненциальной фазы роста малыми дозами этанола приводила к повышению их устойчивости к более высокой концентрации спирта (15%). Инкубация клеток в буфере в отсутствие этанола не приводила к повышению выживаемости в присутствии летальной дозы этанола.
Концентрации этанола для адаптации (1 и 5%) были выбраны в соответствии с данными, представленными на рис. 1. Наибольший положительный эффект был получен после предобработки У. Иро1у-йса этанолом в концентрации 1% (рис. 2, кривая 2).
Повышение летальной концентрации этанола путем предварительной обработки клеток малой дозой (4-6%) было показано для cerevisiae [1]. Более высокая концентрация этанола для положительного эффекта адаптации, вероятно, обусловлена способностью этих дрожжей сбраживать глюкозу до этанола.
Оказалось, что предобработка У. Иро1уНса этанолом (1%, 60 мин) также приводила к повышению устойчивости клеток к воздействию оксидантов и температуры. Как видно на рис. 3, клетки предобра-ботанные этанолом (1%, 60 мин), были более жизнеспособными в условиях теплового (45°С), (кривая 3) и окислительного (120 мМ Н2О2), (кривая 4) стрессов по сравнению с неадаптированными клетками (кривые 1 и 2).
В свою очередь, предобработка У. Иро1уНса нелетальной дозой Н2О2 (0.5 мМ, 60 мин), приводила к повышению устойчивости клеток к высокой дозе
Выживаемость, %
Время, мин
Рис. 3. Влияние предобработки этанолом (1%) на выживаемость Y. lipolytica из фазы экспоненциального роста в условиях теплового (1, 3) и окислительного (2, 4) стрессов: 1, 2 - без предобработки (контроль); 3, 4 - предобработка этанолом (1%, 60 мин).
Выживаемость, %
Время, мин
Рис. 4. Перекрестная устойчивость Y. lipolytica из фазы экспоненциального роста в условиях этанольного стресса (15%): 1 - без предобработки (контроль); 2 -предобработка нелетальной дозой Н2О2 (0.5 мМ, 60 мин); 3 - тепловая предобработка (37°С, 60 мин).
Рис. 5. Содержание цАМФ в клетках Y. lipolytica в условиях этанольного стресса: 1 - без этанола (контроль); 2 - 1% этанола; 3 - 15% этанола.
этанола (15%). При этом жизнеспособность сохраняли около 15% клеток (рис. 4, кривая 2). Сохранение выживаемости на более высоком уровне наблюдалось у клеток после мягкой тепловой предобработки (37°С, 60 мин). В этом случае жизнеспособными оставались около 35% клеток (рис. 4, кривая 3).
Таким образом, Y. lipolytica проявляли выраженную способность к перекрестной адаптации, когда один вид стресса приводит к развитию устойчивости к другим стрессовым воздействиям. Эти результаты согласуются с данными, полученными на cerevisiae [14, 15]. Вероятно, у дрожжей существует общий стрессовый центр (¿ТИБ), активация которого приводит к развитию адаптационных процессов. При этом транскрибируется группа генов, основная функция которых состоит в комплексной защите клеток от нескольких различных стрессоров.
Известно, что у дрожжей cerevisiae транскрипция ряда генов в составе группы 8ТИБ находится под отрицательным контролем протеинкиназы А [14, 16, 17]. Показано, что существует прочная корреляция между активностью цАМФ-зависимой протеинкиназы и термотолерантностью. Мутант-ные штаммы с низкой активностью протеинкина-зы А были заметно более термоустойчивы [18], тогда как мутанты с высокой конститутивной активностью протеинкиназы А были термочувствительны во всех стрессовых условиях [17, 18].
Можно полагать, что одним из сигналов запуска развития адаптивных механизмов клеток в ответ на стрессовые воздействия может быть цАМФ. Ранее [19] показано, что в условиях окислительного и теплового стрессов у Y. Иро^^ наблюдалось снижение уровня этого нуклеотида.
На рис. 5 пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.