МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 2, с. 184-190
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 582.21.05
АДАПТАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA ЫРОЬУТ1СЛ К ТЕПЛОВОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ
© 2007 г. Е. Н. Бирюкова*, А. Г. Меденцев**' А. Ю. Аринбасарова**, В. К. Акименко**
*Пущинский государственный университет, Пущино **Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 08.04.2006 г.
Изучен адаптивный ответ дрожжей Уаггом>1а Иро1у^са на тепловое воздействие. Показано, что дрожжи проявляли высокую чувствительность к температуре, после 10 мин инкубирования при 45^ выживаемость составляла менее 0.1%. Клетки стационарной фазы роста проявляли более высокую термоустойчивость по сравнению с клетками экспоненциальной фазы. Повышение термоустойчивости отмечалось после тепловой предобработки (инкубация в течение 60 мин при 37°C) или действия на клетки низких доз оксидантов (0.5 мМ Н202 или 0.05 мМ менадиона). Показано, что мягкая тепловая обработка клеток приводила к повышению их устойчивости в условиях не только теплового, но и окислительного (120 мМ Н202) стресса. Изучена зависимость термоустойчивости от рН. Показано, что процесс адаптации (мягкая тепловая обработка, воздействие малых доз оксидантов) сопряжен со снижением в клетках уровня цАМФ и увеличением активности антиоксидант-ных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегид-рогеназы).
Ключевые слова: дрожжи Уаггом>1а Иро1у^са, тепловой шок, окислительный стресс, выживаемость, механизм адаптации, цАМФ, каталаза, супероксиддисмутаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глу-татионредуктаза.
Для каждого организма характерны определенные температурные границы, в пределах которых он может развиваться. При повышении температуры выше оптимальной рост клеток дрожжей замедляется или прекращается совсем. В большинстве случаев при повышении температуры параллельно снижению скорости роста происходит увеличение гибели клеток [1, 2].
Стрессовые воздействия, включая тепловой шок, приводят к глобальным изменениям метаболизма клетки, вызывая повреждение мембран, денатурацию и агрегацию клеточных белков. В ответ на изменения окружающей среды микроорганизмы способны включать специальные механизмы адаптации, что обеспечивает им выживание и конкурентоспособность по отношению к другим видам [3].
Механизмы адаптации дрожжей к стрессовым воздействиям, в частности, к тепловому шоку, в настоящее время изучены недостаточно. Представленные в литературе данные носят противоречивый характер, и новые сведения о механизмах устойчивости этих микроорганизмов представляют большой интерес для исследователей.
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: medentsev@ibpm.push-chino.ru).
Целью данной работы было изучение термоустойчивости дрожжей Yarrowia ¡¡ро1уНса различных фаз роста, факторов, влияющих на выживаемость дрожжей в стрессовых условиях, а также корреляции процесса адаптации с изменением содержания цАМФ и активностей антиоксидантных ферментов в клетке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали дрожжи Yarrowia И-ро1уПса ВКМ Y-2378 ^уп. У. ¡¡ро1уПса Y-155), полученные из ВКМ ИБФМ РАН. Культивирование осуществляли при 29°0 в колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды Ридер [4] с глюкозой (1%) на качалке (200 об/мин). Биомассу дрожжей оценивали по оптической плотности при длине волны 540 нм. Клетки отмывали стерильной дистиллированной водой и ресуспенди-ровали в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7.0).
Условия теплового шока были смоделированы путем инкубирования клеток экспоненциальной (10-12 ч) и стационарной (24 ч) фаз роста при температуре 45°С Мягкую тепловую предобработку к тепловому стрессу осуществляли путем преинкубации клеток при 37°0 в течение 60 мин.
Выживаемость клеток определяли путем их высева на чашки Петри с суслом-агаром. Учет колоний осуществляли после 48-72 ч культивирования при 29°C. Представленные данные являются результатом трех независимых экспериментов.
Влияние рН среды на термотолерантность определяли следующим образом: клетки экспоненциальной фазы роста отмывали стерильной дистиллированной водой, суспендировали в 5 мМ фосфатном буфере (рН 7.0). Затем отбирали пробы, доводили рН до 3.0, 4.5, 6.0 и 7.2 и инкубировали на качалке при 29°C в течение 60 мин. После этого 1-2 мл каждой клеточной суспензии переносили в пробирки и инкубировали при 45°C. Через определенные интервалы времени определяли выживаемость клеток.
Экстракцию цАМФ из клеток дрожжей осуществляли 5%-ной хлорной кислотой. Для этой цели 0.9 мл клеточной суспензии, отобранной непосредственно из пробирки, инкубируемой в соответствующих условиях (37°C, 45°C, Н202), вносили в пробирку-эппендорф, содержащую 0.1 мл 50%-ной хлорной кислоты, тщательно перемешивали и инкубировали в ледяной бане в течение 10 мин. Экстракт нейтрализовали 5 N KOH при интенсивном перемешивании, центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин, осадок удаляли. Экстракт хранили при -40°C. Определение цАМФ проводили по стандартной методике, используя набор фирмы "Amersham".
Активность антиоксидантных ферментов, су-пероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионредуктазы, определяли, как описано в работе [4]. Клеточные экстракты для определения активности ферментов получали следующим образом. Клетки дважды промывали дистиллированной водой и суспендировали в 50 мМ трис-фосфатном буфере (рН 7.0), содержащем 0.5 мМ фенилметилсульфо-нилфторида (ФМСФ) - ингибитора протеаз, после чего клетки разрушали на прессе Френча. Гомоге-нат центрифугировали при 105000 g в течение 60 мин. Осадок отбрасывали, а супернатант использовали для определения активности ферментов.
Содержание белка определяли с использованием биуретового реактива.
Спектральные исследования проводили на спектрофотометре Shimadzu (Япония).
В работе использовали коммерческий препарат Н202 (3%), цитохром с фирмы "Sigma"; ФМСФ, ме-надион, ксантин, ксантиноксидазу фирмы "ICN".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 представлены данные, характеризующие чувствительность клеток дрожжей различных фаз роста к тепловому воздействию. Видно, что при
Выживаемость, %
Время инкубации, мин
Рис. 1. Устойчивость клеток У. Иро1уИса экспоненциальной (1,3, 4) и стационарной (2) фаз роста к тепловому шоку: 1, 2 - 45°С; 3 - 37°С; 4 - 45°С, преинкуба-ция при 37°С в течение 60 мин.
45°С выживаемость клеток экспоненциальной фазы роста заметно снижалась: через 5 мин жизнеспособными оставалось 4% клеток, через 10 мин - менее 0.1%. (кривая 1). В отличие от клеток фазы экспоненциального роста, клетки стационарной фазы были более устойчивы к тепловому воздействию, после инкубирования при 45°С в течение 30 мин выживаемость клеток сохранялась на уровне 60% (кривая 2).
Была изучена возможность повышения термоустойчивости дрожжей в результате мягкой тепловой предобработки. Условия предварительного теплового воздействия были выбраны эмпирически. На рис. 1 (кривая 3), видно, что инкубация клеток при 37°С практически не оказывала влияния на их жизнеспособность, которая сохранялась на исходном уровне в течение 60 мин. Оказалось, что указанное тепловое воздействие приводило к заметному увеличению выживаемости (до 40%) при последующей инкубации клеток при 45°С в течение 30 мин (кривая 4).
Ранее на дрожжах Saccharomyces cerevisiae было показано [5], что мягкая тепловая предобработка клеток (37°С) индуцирует толерантность к последующему воздействию более высоких температур. Это явление известно как индуцированная толерантность или тепловая закалка.
Известно, что у микроорганизмов один вид стрессорного воздействия может индуцировать устойчивость к другим стрессорам [3]. Нами была изучена возможность повышения устойчивости клеток к тепловому воздействию путем обработки малыми (нелетальными) дозами оксидантов, Н2О2 или менадиона (супероксидгенерирующего агента) [4]. Как показано на рис. 2 (кривая 2), предобработка клеток экспоненциальной фазы роста нелетальной дозой Н2О2 (0.5 мМ) в течение 60 мин приводила к увеличению выживаемости
Выживаемость, %
Рис. 2. Устойчивость клеток У. Иро1уИса к тепловому шоку (45^) в зависимости от предобработки малыми дозами оксидантов: 1 - клетки без предобработки (контроль); 2 - клетки, предобработанные 0.5 мМ Н2О2 в течение 60 мин; 3 - клетки, предобработанные 0.05 мМ менадиона в течение 60 мин.
Выживаемость, %
Время инкубации, мин
Рис. 3. Устойчивость клеток У. Иро1уИса к действию окислителей (120 мМ Н2О2) в зависимости от тепловой закалки и предобработки малой дозой оксиданта: 1 - клетки без предобработки (контроль); 2 - клетки, преинкубированные при 37^ в течение 60 мин; 3 -клетки, предобработанные нелетальной дозой Н2О2 (0.5 мМ) в течение 60 мин.
(до 30%) при последующем воздействии высокой температуры 45°С Аналогичные результаты по увеличению выживаемости при 45^ были получены после предобработки клеток экспоненциальной фазы роста нелетальной дозой менадиона (0.05 мМ) (кривая 3).
Представлялось важным также определить способность дрожжей развивать устойчивость к окислительному стрессу после мягкой тепловой обработки. На рис. 3 показано, что тепловая закалка приводила к увеличению их устойчивости к окислительному стрессу (кривая 2), вызванному добавлением высокой дозы Н2О2 (120 мМ). Следует отметить, что мягкое тепловое воздействие обеспечивало практически такую же выживаемость клеток, как и предобработка нелетальной дозой Н2О2 (0.5 мМ) (кривая 3).
Таким образом, дрожжи У. ¡¡ро1уНса способны к перекрестной устойчивости к различным стрессовым факторам.
Литературные данные по развитию перекрестной устойчивости у дрожжей при воздействии различных стрессовых факторов малочисленны и противоречивы. Так, клетки Schisosaccharomyces ротЬе после предобработки нелетальной дозой Н2О2 становились резистентными к летальной концентрации оксиданта, высокой температуре (48°C) и этанолу [6, 7]. C другой стороны, клетки S. cerevisiae после предобработки Н2О2 [8] или менадионом [9] оставались чувствительными к повышенной температуре. Кроме того, мягкая тепловая предобработка (37°C) S. cerevisiae не вызывала разви
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.