ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 3, с. 295-303
УДК 579.2:579.6
АДАПТАЦИЯ КОИММОБИЛИЗОВАННЫХ РОДОКОККОВ К НЕФТЯНЫМ УГЛЕВОДОРОДАМ В КОЛОНОЧНОМ БИОРЕАКТОРЕ
© 2014 г. М. К. Серебренникова*, М. С. Куюкина*, **, А. В. Криворучко*, **, И. Б. Ившина*, **
*Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, 614081
e-mail: kuyukina@iegm.ru **Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, 614990
Поступила в редакцию 11.11.2013 г.
Изучена возможность адаптации иммобилизованной на модифицированных опилках ассоциации штаммов Rhodococcus ruber и Rhodococcus opacus к нефтяным углеводородам в колоночном биореакторе. Установлено, что в условиях биореактора повышалась устойчивость бактериальной популяции к углеводородам и антибиотикам, сопровождаемая изменением поверхностных свойств клеток (гидрофобности, электрокинетического потенциала), а также содержания клеточных липидов и биосурфактантов. Показана возможность применения адаптированных родококков для очистки нефтезагрязненной воды в биореакторе.
DOI: 10.7868/S0555109914030301
Развитие нефтяной промышленности приводит к загрязнению окружающей среды нефтепродуктами, а также увеличению объема нефтесодер-жащих сточных вод. Для очистки последних применяют биотехнологические методы, основанные на использовании биореакторов с иммобилизованной на носителе природной или искусственной ассоциацией углеводородокисляющих микроорганизмов [1—3]. Биореакторные технологии дают возможность проводить очистку воды в регулируемых условиях и подбирать оптимальный рабочий режим с целью повышения эффективности осуществляемых биотехнологических процессов. Широкое применение в очистке загрязненных вод получили биореакторы с псевдоожиженным слоем (fluidized bed), заполненные дисперсным носителем с иммобилизованной микрофлорой, через который циркулирует восходящий поток жидкости [4]. Использование реакторов такого типа позволяет :
— осуществлять процессы в небольших по размеру конструкциях;
— обеспечивать равномерное распределение загрязненной жидкости между поддерживаемыми во взвешенном состоянии частицами носителя, что повышает биодоступность углеводородов для закрепленных клеток;
— создавать оптимальные условия для адаптации микроорганизмов к органическим загрязнителям и другим факторам [4, 5].
Биотехнологически перспективной группой микроорганизмов, используемых для очистки нефтезагрязненных сред, являются актинобакте-рии рода Rhodococcus [6, 7]. Занимая доминирующее положение в нефтезагрязненных биотопах, они обладают широким спектром метаболиче-
ских возможностей [8]. Родококки являются активными биодеструкторами токсичных и труднодоступных для многих микроорганизмов углеводородов (алифатических, ароматических, поли- и гетероциклических) и их производных (гербицидов, полихлорированных бифенилов, фармполлю-тантов, фенолов, эстрогенов) [9—11]. Способность родококков использовать нефтяные углеводороды в своем метаболизме обусловлена такими их биологическими особенностями, как сложный мор-фогенетический цикл развития, гидрофобная клеточная стенка, синтез поверхностно-активных веществ (биосурфактантов) [1, 12, 13].
Эффективность биологической очистки сточных вод, загрязненных нефтепродуктами, во многом зависит от стабильной функциональной активности используемых микроорганизмов в условиях залпового поступления в реактор высококонцентрированных промышленных стоков. В связи с этим, перспективно использование микроорганизмов, предварительно адаптированных к высоким концентрациям нефтяных углеводородов.
Цель работы — изучение возможности адаптации коиммобилизованных клеток родококков к повышенным концентрациям углеводородов в условиях лабораторного колоночного биореактора.
МЕТОДИКА
В работе использовали штаммы Rhodococcus ruber ИЭГМ 615 и Rhodococcus opacus ИЭГМ 249 из Региональной профилированной коллекции алка-нотрофных микроорганизмов (ИЭГМ, WDCM № 768; www.iegm.ru/iegmcol/strains).
ч
2
\
г U И|
5 7 \ i
■ШР——J'-*
Рис. 1. Экспериментальная установка по изучению процесса очистки нефтезагрязненной воды иммобилизованными клетками родококков: 1 — модельная нефтезагрязненная вода; 2 — колоночный биореактор, заполненный опилками с иммобилизованными родококками; 3 — перистальтический насос; 4 — магнитная мешалка; 5 — термостатируемая водяная баня.
Способность исследуемых штаммов использовать нефтяные углеводороды. Бактериальные культуры выращивали в минеральной среде RS [14] следующего состава (г/л): KNO3 - 1.0; KH2PO4 - 2.0; K2HPO4 - 2.0; (NH4)2SO4 - 2.0; NaCl - 1.0; MgSO4 • • 7H2O - 0.2; CaCl2 • 2H2O - 0.02; FeCl3 • 7H2O -0.001. В качестве углеродного субстрата использовали индивидуальные н-алканы (декан, ундекан, додекан, тетрад екан, гексадекан, гептадекан, но-надекан), ароматические (фенол) и полиароматические углеводороды (нафталин, фенантрен и антрацен) ("Sigma", США). Для этого в каждую лунку 96-луночного планшета ("Медполимер", С.-Петербург) вносили углеводороды по 6, 12, 30, 50 и 100 мкл, при этом нафталин и фенантрен предварительно растворяли в н-гексане в концентрации 5 мг/мл, а антрацен - 1 мг/мл [15]. После испарения н-гексана на стенках лунок образовывался слой полиароматических углеводородов. К углеводородам добавляли по 100 мкл суспензии (1.0 х х 107 кл./мл) R. ruber или R. opacus в минеральной среде RS. Планшеты закрывали парафиновой пленкой и инкубировали на микропланшетном шейкере-инкубаторе Titramax 1000 ("Heidolph-In-struments", Германия) при 28°C, 160 об/мин в течение 7 сут. После окончания инкубации в каждую лунку добавляли 50 мкл 0.2%-ного раствора йодо-
нитротетразолия хлорида ("Sigma-Aldrich", США), который в присутствии активно респирирующих микроорганизмов восстанавливался до нерастворимого в воде красно-фиолетового формазана [15]. Для полного восстановления красителя планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 сут. Показатель оптической плотности (ОП630 нм) окрашенных культур определяли с помощью микропланшетного фотометра Multiskan Ascent ("Thermo Electron Corporation", Финляндия).
Адаптация родококков к повышенным концентрациям углеводородов в колоночном биореакторе.
Бактерии выращивали в 250 мл колбах Эрлен-мейера, содержащих 100 мл питательного бульона (ПБ) ("ФБУН ГНЦ ПМБ", Россия), при 28°С на орбитальном шейкере ("Certomat/S", Франция) при 160 об/мин. Через 28 ч культивирования клетки центрифугировали при 3000 g 15 мин. Осажденную биомассу дважды отмывали натрий-фосфатным буфером следующего состава (г/л): Na2HPO4 - 3.53; KH2PO4 - 3.39, рН 7.0 [16], ре-суспендировали в этом же буфере и доводили до значения ОП600нм 1.0. На основе полученных суспензий готовили ассоциацию (2.0 х 107 кл./мл, 200 мл) исследуемых штаммов в соотношении 1 : 1. Коиммобилизацию родококков на гидрофоби-зованных хвойных опилках проводили в лабораторном колоночном биореакторе в течение 7 сут при скорости подачи бактериальной суспензии 2.0 мл/мин, как описано ранее [17].
Адаптацию иммобилизованных родококков к повышенным концентрациям углеводородов проводили с использованием модельной нефтезагряз-ненной воды, которую готовили на основе минеральной среды RS с добавлением углеводородов (г/л): н-декан, н-ундекан, н-додекан и н-тетраде-кан — 2.25; н-гексадекан — 2.4; н-гептадекан — 2.34; н-нонадекан — 2.26; пристан — 1.61; нафталин, фенантрен и антрацен — 0.47. Для получения стабильной эмульсии углеводородов к воде добавляли 0.1%-ный раствор твина 60 ("Sigma-Aldrich", США) и обрабатывали на ультразвуковом гомогенизаторе Soniprep 150 ("SANYO", Япония) при 24 кГц в течение 1 мин. Нефтезагрязненная вода непрерывно циркулировала через колоночный биореактор (рис. 1), заполненный хвойными опилками с коиммобилизованными родококка-ми, со скоростью 2.0 мл/мин при температуре 28°С в течение 10 сут. После окончания 1 цикла обработки в биореактор подавали новую порцию нефтезагрязненной воды, содержание углеводородов в которой превышало исходное в 1.5 раза и составляло 29 г/л.
Очистка нефтезагрязненной воды в биореакторе с использованием адаптированных клеток родококков. После завершения процесса адаптации бактерий к нефтяным углеводородам содержимое биореактора промывали натрий-фосфатным буфе-
/
ром. Затем в течение двух последовательных циклов (продолжительность каждого цикла составляла 3 нед) через биореактор с адаптированными родококками прокачивали (2.0 мл/мин) нефтезагрязненную воду с концентрацией углеводородов 19 г/л. Образцы воды для химического анализа отбирали из реактора еженедельно. Количественное содержание алифатических углеводородов определяли после экстракции хлороформом с помощью газового хроматографа 6890N ("Agilent", США) c кварцевой колонкой HP-5 MS SN US 1518974-1 и масс-спектрометрическим детектором MSD 5973 N ("Agilent", США), полиароматических углеводородов — на высокоэффективном жидкостном хроматографе LC Prominence ("Shimadzu", Япония), оборудованном колонкой с обращено-фазовым сорбентом Discovery С18® и ультрафиолетовым детектором RF-10A XL ("Shimadzu", Япония).
Определение суммарных клеточных липидов. Суммарные клеточные липиды в исходных и адаптированных клетках родококков определяли гравиметрически после хлороформ-метанольной экстракции из сухой биомассы, как описано в работе [18]. Для этого биомассу (50 мг) предварительно выращенных в ПБ и отмытых клеток, суспендировали в 1 мл дистиллированной воды. К полученным суспензиям добавляли 4 мл смеси хлороформ—метанол (1 : 2) и встряхивали в течение 2 мин на микровстряхивателе Vortex FS 16 ("BioSan", Латвия) при 2400 об/мин и давали отстояться в течение 1 сут. Затем смесь центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин, осадок повторно экстрагировали 5 мл смеси хлороформ— метанол—вода (1 : 2 : 0.8). Супернатанты объединяли, добавляли 5 мл смеси хлороформ—вода (1 : 1) и центрифугировали. Во взвешенные круглодон-ные 50-мл колбы количественно переносили хло-роформенный слой каждого образца, разбавляли эквивалентным количеством бензола и упаривали на роторном испарителе ("Heidolph", Германия) при 60°С. Колбу взвешивали после достижения постоянно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.