БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2008, № 2, с. 91-94
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ =
УДК 577.113.083:579.8:597
АДАПТАЦИЯ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РЫБАМИ
© 2008 г. Н. Л. Белькова*, Е. В. Дзшба*, Е. В. Суханова**, Т. А. Ханаева*
* Лимнологический институт СО РАН, 664033 Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3,
e-mail: belkova@lin.irk.ru ** Иркутский государственный университет, 664033 Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5
Поступила в редакцию 16.01.2007 г.
Современный метод молекулярно-генетического анализа адаптирован для изучения микроорганизмов, ассоциированных с рыбами. Отработана процедура выделения суммарной ДНК из разных органов и тканей рыб. Показано, что бактериальный ПЦР-продукт амплифицируется на высоко консервативных праймерах при температуре отжига 70-72°С из жабр, печени, кишечника и с поверхностных кожных покровов рыб.
ВВЕДЕНИЕ
Исследования микрофлоры разных экологических групп рыб необходимы при анализе механизмов пищеварения и эффективности питания рыб из естественных ихтиоценозов, для контроля и коррекции питания прудовых популяций, для профилактики и терапии заболеваний организмов, а также для научного обеспечения контроля показателей качества и безопасности рыбного сырья и готовой продукции [1, 6]. Несмотря на то что относительная численность и видовой состав бактерий, населяющих здоровых рыб, представляют несомненный интерес, более важным представляется вопрос о значении для жизнедеятельности рыб этих бактерий. Анализ имеющихся литературных данных показал, что компоненты бактериальной микрофлоры рыб связаны с многочисленными функциями, включающими продукцию полимеров, обволакивающих кожные покровы рыб, синтез эйкозапентаеновой кислоты кишечными бактериями, деградацию комплексных молекул, таких как крахмал (амилазная продукция кишечных бактерий), целлюлоза, фосфолипиды, хитин и коллаген, продукцию витаминов и т.д. [7, 8, 12]. Кроме того, следует отметить, что ряд микроорганизмов, например некоторые представители рода Pseudomonas, вызывают гниение рыбопродуктов, особенно во время их хранения [11]. Надежным, эффективным и удобным инструментом для решения многих прикладных задач в медицинской и пищевой микробиологии становятся молекулярно-генетические методы [9, 13]. Процедура анализа включает такие ключевые стадии, как выделение суммарной ДНК и амплификация [2, 3].
Цель исследования - адаптировать метод выделения суммарной ДНК из разных органов и
тканей рыб и подобрать оптимальные условия амплификации фрагмента гена 16Б рРНК на высоко консервативных бактериальных праймерах.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом для отработки метода послужили разные виды рыб: серебряный карась (Carassius auratus (L.)), черный байкальский хариус (Thymal-lus arcticus baicalensis (Dybowski)), байкальский омуль (Coregonus autumnalis migratorius (Georgi)), малая голомянка (Comephorus dybowski Korotneff) и большая голомянка (C. baicalensis (Pallas)). В работе использованы свежеотловленные рыбы. Все экземпляры были внешне здоровы и качественны. Для выделения суммарной ДНК взяты следующие органы и ткани: жабры, кожа голомянок или кожа и чешуя остальных видов рыб, мышечная ткань (белая мускулатура), печень, гонады самок, желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), который в свою очередь был разделен на три отдела: желудок, пи-лорические придатки, кишечник, у карася - на передний, средний и задний отделы кишечника соответственно.
Пробоотбор и пробоподготовка. Фрагменты органов и тканей рыб отбирали в стерильных условиях, материал сразу же обрабатывали лизи-рующими буферами. Дополнительную обработку использовали только для фрагментов различных отделов ЖКТ. Вырезанные фрагменты ЖКТ объемом 100 мкл вскрывали, промывали 3 раза в трис-фосфатном буфере (1 мл, рН 7.4) для удаления неприкрепленных бактерий. Далее обрабатывали лизирующими растворами в зависимости от используемого метода (см. таблицу).
Особенности отдельных методов выделения ДНК, использованных в работе
Стадия
Наборы фирмы 'АмплиСенс", г. Москва
Метод модифицированной цетавлоновой очистки
Метод ферментативного лизиса с фенол-хлороформной экстракцией
Лизис
Удаление клеточного дебриса
Осаждение ДНК
Удаление белков и полисахаридов
Осаждение ДНК
Растворение/смыв ДНК
Лизирующий раствор, рекомендованный фирмой
Центрифугирование 10 мин
Добавление сорбента к супернатанту
Обработка сорбента растворами для отмывки согласно инструкции производителя
Стерильная дистиллированная вода или РНК-элюэнт
Лизирующий буфер 100 мМ трис-HCl, pH 8.0, 1.4 М NaCl, 2% цетавлона, 20 мМ ЭДТА
Центрифугирование 10 мин
Обработка РНКазой и проте-иназой К
Обработка 1%-ным водным цетавлоном, замораживание-оттаивание. Осадок экстрагируют этанолом, добавляют 3 М ацетат натрия
Стерильная дистиллированная вода или ТЕ-буфер
Лизирующий буфер 10 мМ трис-HCl, pH 7.5, 0.1 M NaCl, 2 мМ ЭДТА, 10 мг/мл лизоцим; через 30 мин добавление SDS до 1%
Фенол-хлороформная экстракция
3 M ацетат натрия, изоамило-вый спирт
Стерильная дистиллированная вода или ТЕ-буфер
Выделение суммарной ДНК проводили, используя наборы РИБО-сорб, ДНК-сорб А и ДНК-сорб Б ("АмплиСенс", г. Москва) по прилагаемой инструкции с небольшими модификациями. Кроме того, использовали недавно предложенный модифицированный метод цетавлоновой очистки ДНК [4] и метод ферментативного лизиса с фенол-хлороформной экстракцией (см. таблицу). ДНК элю-ировали безбактериальной стерильной водой.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). В работе использованы праймеры, комплементарные наиболее консервативным участкам гена 16S рРНК бактерий (в скобках дана нумерация нуклео-тидов по Escherichia coli) 500L (514-533) и 1350R (1389-1407) [5]. Выделенную суммарную ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции и подбирали режим, обеспечивающий высокое качество ПЦР-продукта нужной длины. Амплификацию вели в разных условиях, в том числе проверяли температуру отжига в градиенте температур от 44 до 72°С в амплификаторе DNA Engine DYADTM. Продукты амплификации анализировали разделением фрагментов ДНК в 1.5%-ном агарозном геле. Секвенирование осуществляли на автоматическом секвенаторе Beckman Coulter CEQ 8 800 Genetic Analysis System в Иркутском приборном центре коллективного пользования СО РАН.
РЕЗУЛВТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Суммарная ДНК выделена из 70 проб разных органов и тканей рыб. Использование разных сорбентов и методов для выделения суммарной
ДНК показало, что наиболее оптимальны набор РИБО-сорб ("АмплиСенс" г. Москва) и метод ферментативного лизиса с фенол-хлороформной экстракцией. Учитывая, что для практического применения методики в широком масштабе (использование в различных областях аквакультуры и коммерческом рыбоводстве) принципиальна простота фиксации бактериального материала, скорость проведения процедуры выделения ДНК и воспроизводимость всех этапов эксперимента, aвторы рекомендуют методику выделения суммарных нуклеиновых кислот с использованием набора РИБО-сорб ("АмплиСенс", г. Москва).
Для амплификации бактериальной ДНК выбрана пара высоко консервативных праймеров. Проверка этих праймеров с использованием базы данных Ribosomal Database Project II (http:// rdp.cme.msu.edu/) показала, что они действительно обладают высокой консервативностью. В качестве матрицы использовали препараты суммарной ДНК, выделенной из разных отделов желудочно-кишечного тракта разных рыб. В результате ПЦР при условиях, обеспечивающих получение максимального разнообразия бактериальных последовательностей [5], было получено два основных продукта длиной ~800 и 900 пар оснований (п.о.). Следует отметить, что длина бактериального ПЦР-продукта составляет около 800 п.о. Амплификация с градиентом температуры отжига от 44 до 72°С показала, что на всех препаратах ДНК получается ПЦР-продукт длиной ~900 п.о. при температуре отжига ниже 48-64°С. С увеличением температуры увеличивалась интенсивность полосы, соответствующей ПЦР-продукту бактериального проис-
АДАПТАЦИЯ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА 93
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Рис. 1. Результаты электрофоретического анализа продуктов амплификации суммарной ДНК, выделенной из кишечника карася, с градиентом температуры отжига от 50 до 72°С: 1 - 50.0, 2 - 50.6, 3 - 51.9, 4 - 53.5, 5 - 56.0, 6 - 59.2, 7 - 62.9, 8 - 66.0, 9 - 68.5, 10 - 70.2, 11 - 71.5, 12 - 72.0°С.
хождения длиной ~800 п.о. (рис. 1). Следует отметить, что для разных видов рыб самая низкая температура отжига, при которой фиксируется бактериальный ПЦР-продукт, варьирует от 50°С (карась) до 64-68°С (хариус, большая и малая голомянки). Кроме того, при температуре отжига 72°С для некоторых проб ЖКТ рыб был получен как основной только бактериальный ПЦР-продукт (кишечник карася, большой и малой голомянки), в остальных случаях присутствовала слабая полоса длиной ~900 п.о. Секвенирование этого ПЦР-продукта, полученного на препарате суммарной ДНК хариуса, показало, что на этой паре праймеров амплифицируется фрагмент гена 18Б рРНК рыб. Таким образом, показано, что оптимальная температура отжига для получения бактериального ПЦР-продукта на препаратах суммарной ДНК 70-72°С.
Отработанные условия амплификации применены для амплификации суммарной ДНК, выделенной из разных органов и тканей свежеотлов-ленных рыб. Получены бактериальные ПЦР-про-дукты с препаратов ДНК, выделенной из жабр, кожных покровов и печени. Следует отметить, что неоднозначными оказались результаты амплификации препаратов ДНК, выделенной из мышечной ткани и гонад самок. Препараты суммарной ДНК выделены из 10 особей хариуса. При амплификации препаратов суммарной ДНК, выделенной из мышечной ткани, в трех случаях получены очень слабые полосы бактериального продукта, а с одной матричной ДНК получили яркий ПЦР-продукт (рис. 2). В остальных случаях ПЦР-продукт бактериального происхождения не был получен. При анализе препаратов ДНК из гонад самок в четырех случаях из десяти получена только слабая полоса, соответствующая бактериальному ПЦР-продукту, яркую и характерную полосу, со-
Рис. 2. Результаты электрофоретического анал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.