научная статья по теме АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ РАСТЕНИЙ: ВЛИЯНИЕ БИОТИЧЕСКОГО СТРЕССОРА НА КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ТРАНСМЕМБРАННОЙ И “РАСТВОРИМОЙ” ФОРМ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ Биология

Текст научной статьи на тему «АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ РАСТЕНИЙ: ВЛИЯНИЕ БИОТИЧЕСКОГО СТРЕССОРА НА КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ТРАНСМЕМБРАННОЙ И “РАСТВОРИМОЙ” ФОРМ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ»

УДК 581.11.2:581.573.4

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ РАСТЕНИЙ: ВЛИЯНИЕ БИОТИЧЕСКОГО СТРЕССОРА НА КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ТРАНСМЕМБРАННОЙ И "РАСТВОРИМОЙ" ФОРМ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ

© 2014 г. Л. А. Ломоватская*, А. С. Романенко, Н. В. Филинова

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск, 664033, ул. Лермонтова, 132, а/я 317;

*электронная почта: LidaL@sifibr.irk.ru Поступила в редакцию 05.06.2013 г.

Синтезирующие сАМР трансмембранная и "растворимая" формы аденилатциклазы (тмАЦ и рАЦ соответственно) про- и эукариот — ключевые ферменты аденилатциклазного сигнального пути. Ранее мы обнаружили тмАЦ и рАЦ в клетках растений картофеля, в том числе, в ядрах и хлоропластах. В представленной работе приведены данные о противоположном влиянии биотического стрессора, в частности, внеклеточных полисахаридов бактериального возбудителя, вызывающего кольцевую гниль картофеля, на кинетические параметры АЦ из сортов картофеля, устойчивых и чувствительных к данному патогену (стимуляция и подавление активности соответственно). Показано, что тмАЦ и рАЦ являются важными компонентами аденилатциклазного сигнального пути, которые обеспечивают в растениях устойчивого к биотическому стрессу сорта более быструю, чем в растениях восприимчивого сорта, трансдукцию "сигнала тревоги" для запуска защитных ответов.

Ключевые слова: картофель, аденилатциклазы, внеклеточные полисахариды, кольцевая гниль, устойчивость, восприимчивость.

DOI: 10.7868/S0233475514010071

Способность растений противостоять стрессовым воздействиям и сохранять при этом высокий жизненный потенциал зависит от возможности реализовать защитно-приспособительные механизмы. Сигнальные системы растений служат посредниками между клеточными детерминантами, воспринимающими стрессовый сигнал, и геном-содержащими органеллами, в которых активируются соответствующие гены [1, 2]. Одна из таких систем — аденилатциклазный сигнальный каскад, один из ключевых компонентов которого аденилатциклаза (АЦ), катализирующая образование сАМР из АТР. У млекопитающих идентифицированы девять изоформ трансмембранной АЦ (тмАЦ), которые кодируются девятью генами, локализованными в разных локусах хромосом [3], и две изоформы "растворимой" АЦ (рАЦ): так называемая полноразмерная изоформа с предсказанной молекулярной массой 187 кДа, а также каталитически активная усеченная изо-форма размером 48 кДа [4]. Усеченная изоформа, как полагают, является продуктом сплайсинга гена полноразмерной рАЦ [4]. У бактерий и одноклеточных эукариот найдены обе формы АЦ, структура и физиологические свойства которых обладают не только сходством с АЦ животных, но имеют и отличия от них [5—7].

Предполагается, что структура и функции растительных тмАЦ во многом соответствуют структуре и функциям АЦ животных клеток. Это мнение основано на том, что такие эффекторы животных тмАЦ, как форсколин, фторид, холерный токсин, О-белки и Са2+/кальмодулин, сходным образом влияют на тмАЦ растений [6, 8]. Напротив, "растворимая" АЦ млекопитающих нечувствительна к перечисленным соединениям, но активируется ионами бикарбоната [9, 10]. На возможное присутствие этой формы АЦ в растениях указывают результаты, полученные только в некоторых публикациях. Так, СатеаЛе и др. [11] выделили из корней люцерны фракцию, содержащую рАЦ, активность которой стимулировалась ионами Са2+ и кальмодулином, но не изменялась в присутствии форсколина, фторида и холерного токсина. В растениях табака [12] ив пыльцевых трубках лилии идентифицированы белки [13], которые, предположительно, являются рАЦ.

Ранее мы выявили тмАЦ, а также рАЦ в клетках растений картофеля, в том числе, в ядрах и хлоропластах [6, 14]. Здесь мы показываем, что стрессор биотической природы — внеклеточный полисахарид бактериального возбудителя кольцевой гнили картофеля, влияет на кинетические

4

129

параметры тмАЦ и рАЦ сортов картофеля, устойчивых и чувствительных к этому патогену. Для изучения этих параметров использовали зону корня, подвергнутую воздействию указанным биотическим стрессовым фактором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. Использовали растения двух сортов картофеля: Луговской (устойчивый) и Лукьяновский (чувствительный). Эти сорта различаются по степени устойчивости к Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Spieck. et Kott.) Skaptason et Burkh. (Cms) — патогену, вызывающему кольцевую гниль картофеля. Двухнедельные растения выращивали in vitro на жидкой солевой среде Мурасиге и Скуга с добавлением: 20 г/л сахароза (Реахим, Россия), 1.0 мг/л тиамин, 0.5 мг/л пиридоксин, 0.1 мг/л индолил-3-масля-ная кислота и 0.02 мг/л феруловая кислота (Sigma, США). Пробирки с растениями помещали в ростовую камеру со следующим режимом: 16 ч свет, 6 клк, 20°C/8 ч темнота, 15°C.

Выделение и очистка внеклеточных полисахаридов (ЭПС). Вирулентный штамм 5369 Cms, полученный из НИИ картофеля (Коренёво, Московская область), выращивали в колбах с жидкой питательной средой, содержащей 10 г/л экстракта дрожжевого автолизата (Sigma, США), 15 г/л глюкозы и 5 г/л CaCO3 (Реахим, Россия) в течение 2 нед при 23°C в темноте. ЭПС, продуцируемые бактерией, выделяли и очищали следующим образом. Бактериальные клетки удаляли из культу-ральной жидкости центрифугированием при 2000 g в течение 30 мин. Супернатант последовательно пропускали через колонки 20 х 2.5 см, заполненные ионообменными смолами Dowex-1 и Dowex-50 W, ионные формы COO- и H+ соответственно (Sigma). Элюат концентрировали в роторном испарителе под вакуумом до объема 100— 150 мл, ЭПС осаждали ацетоном. Преципитат замораживали, высушивали и хранили при 4°C.

Для создания биотического стресса корни ин-тактных растений картофеля погружали на 1 мин в жидкую ростовую среду, приготовленную на основе среды Мурасиге и Скуга, рН 7.2 и содержащую 0.1% ЭПС Cms.

Приготовление образцов для определения кинетических параметров АЦ. Для определения кинетических параметров АЦ использовали корни ин-тактных растений картофеля (по 15 растений в каждом варианте).

Образцы фиксировали в жидком азоте и гомогенизировали в среде выделения следующего состава (Fluka, Германия): 50 мМ трис-НО-буфер, рН 7.2, 0.1 мМ теофиллин (ингибитор фосфоди-эстеразы), 1 мМ дитиотреитол (протектор SH-групп), 0.5 мг/мл поливинилпирролидон

(связывающий фенолы), 50 мкг/мл фенилметил-сульфонилфторид (ингибитор сериновых проте-аз), 50 мкг/мл я-гидроксимеркурибензоат (ингибитор протеаз), 1 мкг/мл лейпептин (ингибитор сериновых и цистеиновых протеаз). Грубый гомо-генат фильтровали через мелкоячеистый капрон, осадок удаляли, а фильтрат центрифугировали в течение 40 мин при 20000 g для осаждения и последующего удаления обломков клеточных стенок и органелл. Супернатант центрифугировали в течение 1 ч при 100000 g для получения в осадке фракции микросом. Осадок ресуспендировали (1 : 1 по объему) в 25 мМ трис-НС1-буфере, рН 7.5, + 0.3 М сахарозы и хранили при —80°С. Эта суспензия служила источником тмАЦ, а в су-пернатанте, сохраняемом при такой же температуре, определяли активность рАЦ.

Электронная микроскопия. Образцы микросо-мальной фракции фиксировали в растворе, состоящем из смеси 4% формальдегида и 1% глута-рового альдегида на 0.1 М фосфатном буфере рН 7.2 в течение 2 ч, трижды промывали таким же буфером и дофиксировали в 1% OsO4 на 0.08 М фосфатном буфере в течение 2 ч. После обезвоживания по стандартной схеме образцы заключали в смесь эпоксидных смол аралдита и эпона (Fluka, Германия). Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме (Reichert, Австрия) и монтировали на никелевых сеточках. Для избирательного контрастирования плазматической мембраны с целью оценки ее чистоты в микросомальной фракции, сеточки помещали на капли водного раствора смеси 1% фосфорновольфрамовой кислоты и 10% хромового ангидрида (Реахим, Россия) на 3 мин и ополаскивали дистиллированной водой [15]. Срезы просматривали и фотографировали в трансмиссионном электронном микроскопе LEO 906E (Carl Zeiss, Германия).

Определение кинетических параметров АЦ. Активность АЦ определяли путем выявления сАМР в образце с помощью модифицированного нами метода иммуноферментного анализа (ИФА) [16] с использованием специфичных к сАМР первичных поликлональных кроличьих антител (Sigma, США) и вторичных козьих антител, меченных пе-роксидазой хрена (Sigma, США). Реакцию инициировали внесением образца (150 мкг белка) в 0.5 мл инкубационной среды, содержащей 50 мМ трис-HCl, pH 7.2 (оптимум pH для активностей тмАЦ и рАЦ), АТР в концентрации 0.07 мМ, 0.1 мМ, 0.2 мМ, 0.3 мМ, 0.4 мМ и 0.5 мМ, 1 мМ дитиотреитол, 1 мкг/мл лейпептин и 0.1 мМ теофиллин (Sigma). В пробы из осадка добавляли 3 мМ MgSO4, в супернатант - 3 мМ MnC12 (Реахим, Россия) — кофакторы для тмАЦ и рАЦ соответственно. В некоторые образцы добавляли специфические модуляторы АЦ: 10 мМ NaF для стимуляции тмАЦ или 20 мМ NaHCO3 (Реахим, Россия) для активации рАЦ. В отдельные образ-

Таблица 1. Влияние сурамина (10 мкМ) на активность трансмембранной АЦ (нмоль сАМР/мг белка в мин) в микросомальной фракции корней картофеля in vitro

Сорт Луговской Сорт Лукьяновский

Вариант корни, активность тмАЦ

контроль cурамин % к контролю контроль cурамин % к контролю

ЭПС +ЭПС 7.3 ± 0.5 57.0 ± 7.2 0.2 ± 0.01 1.7 ± 0.08 2.7 2.9 3.3 ± 0.1 2.2 ± 0.1 0.1 ± 0.01 0.1 ± 0.01 3.0 4.5

цы добавляли специфический ингибитор тмАЦ — 10 мкМ сурамин (Sigma) или специфический ингибитор рАЦ млекопитающих — 30 или 50 мкМ 2-(1Н-бензоимидазол-2-сульфанил)-пропионовая кислота-(5-бромо-2-гидроксибензилиден)-гидра-зид (KH-7), любезно предоставленный сотрудниками лаборатории Buck и Levin (Medical College of Cornell University, США). Реакцию проводили в течение 30 мин при 27°C и останавливали кипячением проб в течение 3 мин на водяной бане.

Образцы очищали от всех циклических нук-леотидов за исключением сАМР на колонке с нейтральным оксидом алюминия (объем слоя 1 см3). При проведении ИФА для иммобилизации антигена готовили смесь, содержащую 1 мл изучаемого образца, 0.08 мл 25% глутарового альдегида (Sigma), 1 мг/мл БСА (Sigma), из которой аликвоты объемом по 0.1 мл помещали в ячейки полистироловых планшетов. Планшет

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком