КОЛЛОИДНЫЙ ЖУРНАЛ, 2011, том 73, № 1, с. 26-29
УДК 544.72:577.112.824
АДСОРБЦИЯ БИОГЕННЫХ АМИНОВ НА ПОВЕРХНОСТИ КРЕМНЕЗЕМА, МОДИФИЦИРОВАННОГО АЛЬБУМИНОМ
© 2011 г. Н. Н. Власова, О. В. Маркитан, Л. П. Головкова
Институт химии поверхности им. А.А. Чуйко Национальной академии наук Украины 03164 Киев-164, ул. Генерала Наумова, 17 natalie.vlasova@gmail.com Поступила в редакцию 24.02.2010 г.
Изучена адсорбция биогенных аминов — триптамина и тирамина из водных растворов на поверхности высокодисперсного кремнезема, адсорбционно-модифицированного бычьим сывороточным альбумином, в зависимости от рН и концентрации адсорбата. Показано, что модификация поверхности кремнезема альбумином приводит к расширению диапазона рН, при котором происходит адсорбция аминов из водных растворов.
ВВЕДЕНИЕ
Биогенные амины — биологически важные азотсодержащие соединения в растительных, бактериальных и животных клетках [1]. Они образуются в основном за счет декарбоксилирования аминокислот или аминированием альдегидов и кетонов. Хотя многие из биогенных аминов выполняют важные метаболические функции в работе нервной и сосудистой систем человека, потребление с пищей их избыточных количеств имеет токсикологический эффект и рассматривается как причинный фактор пищевых отравлений [2]. Известно, что высокодисперсный кремнезем при лечении пищевых отравлений и аллергии оказывает положительное действие [3], которое может быть обусловлено связыванием и выведением токсических веществ из организма, в том числе и биогенных аминов.
Ранее нами была изучена адсорбция некоторых биогенных аминов на поверхности высокодисперсного кремнезема из водных растворов в зависимости от рН и ионной силы. Были определены состав и устойчивость поверхностных комплексов, образующихся за счет взаимодействия диссоциированных силанольных групп с катионами аминов [4]. Известно, что кремнезем обладает высоким сродством по отношению к белкам [3], поэтому можно предположить, что при использовании его в качестве эн-теросорбента на его поверхности в первую очередь будут адсорбироваться белки, присутствующие в биологических жидкостях.
Целью настоящего исследования было изучение влияния альбумина, закрепленного на поверхности кремнезема, на адсорбцию триптамина и тирамина из водных растворов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали высокодисперсный аморфный кремнезем А-300 (г. Калуш, Украина), триптамина гидрохлорид и тирамина гидрохлорид ("ч. д .а.", Fluka, Швейцария), бычий сывороточный альбумин (БСА, >98%, молекулярная масса 67000, Fluka, Швейцария), стандарт-титры NaOH и HCl (Titrisol, Merck, Германия), хлорид натрия ("х. ч.", Merck, Германия). Фосфатный буферный раствор (pH 7.4) был приготовлен из NaH2PO4 • • 2H2O и Na2HPO4 • 12H2O ("ч. д. а.", Реахим, Россия).
Образцы высокодисперсного кремнезема, модифицированные альбумином, были получены в результате адсорбции белка из водного раствора. Навеску БСА (6 г) растворяли в 500 мл воды, добавляли 10 г высокодисперсного кремнезема, перемешивали систему и доводили ее pH до 5. Через час после получения суспензию центрифугировали, отделяли кремнезем, трижды промывали водой, фильтровали и сушили при комнатной температуре. В оставшихся равновесном растворе и фильтратах определяли концентрацию альбумина по полосе поглощения в УФ-спектре (X = 268 нм), используя предварительно построенный калибровочный график. Таким способом был получен образец кремнезема с содержанием альбумина 430 мг/г сорбента, что соответствует 300 мг белка в 1 г образца.
Адсорбцию аминов — тирамина и триптамина — изучали при комнатной температуре (20 ± 2°С). По 10 мл растворов аминов (1 ммоль/л) добавляли к навескам белоксодержащего кремнезема (0.1 г) и доводили pH систем до необходимого значения в интервале 2—8. Пробы перемешивали в течение 1 час (предварительно было установлено, что этого времени достаточно для достижения равновесия адсорбции), периодически проверяя значе-
ние рН (иономер ЭВ-74). После центрифугирования (8000 об./мин, 20 мин) отделяли кремнезем и спектрофотометрически определяли концентрацию амина (спектрофотометр Зресогё М-40, Германия).
Предварительно были изучены спектры поглощения обоих аминов в УФ-области в зависимости от концентрации и рН их растворов. Было установлено, что для триптамина и тирамина положение полос поглощения и их интенсивность не зависят от рН; при этом для триптамина ^тах = 279 нм, е = = 5660 л моль-1 см-1, для тирамина ^тах = 275 нм, е = = 1560 л моль-1 см-1. Полосы поглощения аминов практически совпадают со спектром поглощения БСА, поэтому равновесные концентрации аминов определяли по интенсивности их полос поглощения после вычитания поглощения, соответствующего концентрации белка, десорбирующегося в раствор при данном значении рН.
Для изучения десорбции БСА к навескам (0.1 г) белоксодержащего кремнезема (300 мг/г) добавляли по 10 мл раствора хлорида натрия (0.01 М). Доводили рН до необходимого значения и через час измеряли концентрацию БСА, перешедшего в раствор. Величины адсорбции аминов определяли по разнице исходной и равновесной концентраций и выражали их в %. Такая же методика была использована для изучения зависимости адсорбции от концентрации адсорбата при физиологическом значении рН, равном 7.4. Десорбцию белка при рН 7.4 определяли, добавляя к 0.1 г образца 10 мл фосфатного буферного раствора. Величины адсорбции, рассчитанные по разности исходной и равновесной концентраций, выражали в ммоль/г.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сывороточный альбумин - основной транспортный белок крови - является переносчиком множества разнообразных химических соединений. Аминокислотный состав и размеры молекул БСА и альбумина сыворотки человека очень близки, незначительно различается и их молекулярная масса. Определена последовательность всех 582 аминокислот для обеих молекул [5]. При нейтральных рН молекула альбумина представляет собой компактную глобулу, эллипсоид с осями вращения 14-15 нм и 4-5 нм. При рН < 3 и >8 молекула альбумина "разворачивается". При "разворачивании" значительно изменяются многие физико-химические свойства белка, например, число подвижных протонов, способных обмениваться с дейтерием. При физиологических значениях рН (7.4) в ионизированном состоянии находится 100 карбоксильных групп ас-парагиновой и глутаминовой кислот (рК = 4.1), 57 е-аминогрупп лизина (рК = 9.5) и 23 гуанидино-вые группы аргинина (рК > 12), т.е. молекула БСА в целом заряжена отрицательно. Выполненные в последние годы [6, 7] исследования структуры сыво-
рН
Рис. 1. Зависимости адсорбции сывороточного альбумина (1) (СБСА = 12 мг/мл, С8Юг = 20 г/л, 0.01 М КаС1) и концентрации белка (2), десорбирующегося с поверхности кремнезема, содержащего 300 мг/г альбумина, в 0.01 М раствор №С1, от рН.
роточного альбумина позволили уточнить форму белковой молекулы. Было показано, что макромолекула в "свернутом" состоянии имеет сердцеобразную форму, а в "развернутом" - сигарообразную.
Изучению адсорбции сывороточного альбумина на поверхности кремнезема посвящено большое количество работ, например [8-10], в которых показано, что зависимость адсорбции от рН имеет ко-локолообразную форму, причем максимум адсорбции наблюдается при рН около 5, что соответствует изоэлектрической точке белка [11]. Можно предположить, что максимум адсорбции наблюдается для "свернутых" компактных молекул альбумина. Отмечается, что при рН 5 на высокодисперсном кремнеземе адсорбируется до 700 мг белка в расчете на 1 г сорбента [3], что соответствует практически полному заполнению всей доступной поверхности. При "разворачивании" размеры молекул белка увеличиваются, поэтому для них необходимо больше места на поверхности кремнезема. Величина адсорбции при этом уменьшается.
Полученная в данной работе зависимость адсорбции БСА от рН представлена на рис. 1. На этом же рисунке приведены концентрации белка, десор-бирующегося в 0.01 М раствор №С1, выраженные в величинах, на которые уменьшается содержание БСА на поверхности (мг/г). Изучение десорбции белка с поверхности кремнезема показывает, что наибольшее количество альбумина переходит в кис-
28
ВЛАСОВА и др.
В исследуемом интервале рН все амины существуют в виде протонированных по аминогруппе катионов, о чем свидетельствуют высокие константы протонирования (таблица). Можно предположить, что при адсорбции из слабощелочных растворов взаимодействие между положительно заряженными катионами аминов и отрицательно заряженными в целом молекулами альбумина способствует закреплению аминов на поверхности. С другой стороны, наличие адсорбции в кислой области рН позволяет предположить, что "разворачивание" молекул белка делает более доступными локальные центры связывания аминов, а "свернутость" молекул альбумина в изоэлектрической точке препятствует такому проникновению аминов. При этом тирамин адсорбируется в большей степени, чем триптамин. Возможно, взаимодействие триптамина с белком более специфично, поскольку в молекуле БСА существуют особые центры связывания производных индола (в том числе и триптофана — аминокислоты, родственной триптамину) [5]. На рис. 3 приведена схема возможного взаимодействия протонированных аминов (АтН+) с различными формами альбумина, адсорбированными на поверхности кремнезема.
На рис. 4 представлены изотермы адсорбции биогенных аминов на поверхности исходного и бе-локсодержащего кремнеземов. Рассчитанные по уравнению Ленгмюра константы и величины максимальной адсорбции приведены в таблице. Константы адсорбции аминов на исходном кремнеземе примерно на порядок меньше, чем те же константы, характеризующие адсорбцию аминов на поверхности белоксодержащего кремнезема. Максимальная адсорбция тирамина примерно одинакова для обоих адсорбентов, а для триптамина величина максимальной адсорбции при взаимодействии с белоксо-держащим сорбентом существенно меньше, чем при адсорбции на немодифицированном кремнеземе. Возможно, этот факт также подтверждает необходимость специфического взаимодействия трипта-мина с молекулой альбумина. Интересно отметить, что константа связывания серотонина (5-окситрип-
Параметры адсорб
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.