научная статья по теме АДСОРБЦИЯ -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ НА КРЕМНЕЗЕМНЫХ И АЛЮМОСИЛИКАТНЫХ АДСОРБЕНТАХ Химия

Текст научной статьи на тему «АДСОРБЦИЯ -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ НА КРЕМНЕЗЕМНЫХ И АЛЮМОСИЛИКАТНЫХ АДСОРБЕНТАХ»

ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 89, № 3, с. 497-501

ФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ ЯВЛЕНИЙ

УДК 577.150.3

АДСОРБЦИЯ ß-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ НА КРЕМНЕЗЕМНЫХ И АЛЮМОСИЛИКАТНЫХ АДСОРБЕНТАХ

© 2015 г. Л. Ф. Атякшева, И. В. Добрякова, О. С. Пилипенко

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет E-mail: Atyaksheva@phys.chem.msu.ru Поступила в редакцию 27.05.2014 г.

Показано, что величина адсорбции ß-галактозидазы грибов Aspergillus oryzae на мезопористых и би-пористых кремнеземных и алюмосиликатных адсорбентах и скорость процесса увеличивается с ростом диаметра пор адсорбента. Установлено, что в зависимости от текстуры адсорбента меняется также и вид изотерм адсорбции; константа Михаэлиса в реакции гидролиза о-нитрофенил-ß-D-ra-лактопиранозида возрастает от 0.3 мМ для фермента в растворе до 0.4—0.5 мМ для фермента на поверхности. Сделан вывод, что максимальной активностью обладает ß-галактозидаза на поверхности бипористых адсорбентов.

Ключевые слова: адсорбция, ß-галактозидаза, кремнеземные и алюмосиликатные адсорбенты.

DOI: 10.7868/S0044453715030036

ß-Галактозидаза (КФ 3.2.1.23) — фермент углеводного обмена. Одна из ее функций — гидролиз молочного сахара (лактоза) на два легко усваиваемых моносахарида (глюкоза и галактоза). Поскольку значительная часть населения Земли [1] из-за недостатка ß-галактозидазы не способна усваивать молочные продукты, этот фермент широко используется при производстве молочных продуктов с пониженным содержанием лактозы для детского и диетического питания [2]. Помимо гидролазной активности ß-галактозидаза катализирует также реакции трансгалактозилирования с образованием олигосахаридов, в связи с чем активно обсуждается перспектива промышленного применения ß-галактозидазы для производства олигосахаридов, входящих в состав лечебно-профилактических продуктов питания [3, 4]. В опубликованном в 2012 году обзоре [5], посвященном практическому использованию иммобилизованных ферментов, описано практическое использование биокатализаторов на основе иммобилизованной ß-галактозидазы. Так, например, для синтеза олигосахаридов использована ß-галактозидаза Aspergillus oryzae, иммобилизованная на подложке на основе поливинилацетата. Этот же фермент, иммобилизованный на конканавалине, нанесенном на поверхность наночастиц оксида цинка, исследован в реакции гидролиза лактозы. Авторы [5] приводят сведения об использовании ß-галак-тозидаз из различных источников для получения биосенсоров.

В связи с практическим использованием биокатализаторов на основе адсорбционных слоев ферментов постоянно ведется поиск адсорбентов, пригодных для получения таких катализаторов. С конца 90-х годов прошлого столетия внимание исследователей привлечено к адсорбции ферментов на мезопористых молекулярных ситах, таких как МСМ-41, MCF, SBA-15. В дальнейшем для адсорбции ферментов использованы макро-, мезопористые кремнеземы [6, 7] и кремнеземы с бимодальным распределением пор (би-пористые) [8—10].

На макро-, мезопористых кремнеземах иммобилизованы ß-галактозидазы бактерий Bacillus circulans [7, 11], дрожжей Kluyveromyces lactis [6, 11] и грибов Aspergillus oryzae [11]. Как правило, наиболее доступные ß-галактозидазы микроорганизмов — олигомерные ферменты, обладающие большими молекулярными массами. Для ди-мерного фермента бактерий Bacillus circulans MR = = 212000 [12], для тетрамерного фермента из грибов Penicillium canescens Мк > 420000, а размер молекулы 12 х 12 нм [13], диаметр молекулы дрожжевой ß-галактозидазы из Kuveromyces lactis—14 нм, а MR = 240000 [14]. Существуют ß-галактозидазы и с большими молекулярными массами [15]. В связи с этим важную роль в адсорбции ß-галакто-зидаз играет характер пористости адсорбента.

Цель данного исследования — изучение адсорбции ß-галактозидазы на адсорбентах с различными параметрами пористой структуры. В качестве адсорбата выбрана ß-галактозидаза из гри-

Таблица 1. Параметры пористой структуры и адсорбционные свойства кремнеземных и алюмосиликатных адсорбентов

Адсорбент ^БЭТ м2/г см3/г Dmax, нм A

мг/г мкг/м2

Силохром 130 1.0 75 13.5 104

Мезопористый кремнезем 500 0.4 3.0 0.6 1.2

Кремнезем SBA-15 1000 1.2 9.5 5.7 5.7

Алюмосиликат SBA-15 370 1.3 20 31.2 84.3

Бипористый кремнезем 930 1.9 4 и 50 15.2 и 96 16.3 и 103

Бипористый алюмосиликат 840 2.1 3 и 30 14.4 и 85 17.1 и 101

Обозначения: Dmax — положение максимума на кривые распределения объемов пор по их размерам, A — предельная адсорбция, полученная обработкой изотерм в координатах уравнения Ленгмюра.

бов Aspergillus oryzae. Этот фермент не образует четвертичной структуры и представляет собой мономер с MR ~ 100000 [16].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Адсорбенты. Исследованы кремнеземные и алюмосиликатные адсорбенты, параметры пористой структуры которых приведены в таблице 1. Все адсорбенты кроме силохрома синтезированы авторами по известным методикам. При синтезе мезопористого кремнезема в качестве источника кремния использовали тетраэтоксисилан (ТЭОС, Aldrich), а в качестве темплата — полиэтиленгли-коль (Loba). Неионогенный ПАВ Pluronic P123 использовали в качестве темплата при синтезе адсорбентов со структурой SBA-15. Источником кремния также служил ТЭОС. При синтезе алюмосиликатов помимо указанных реагентов использовали алюминат натрия в качестве источника алюминия. При синтезе бипористых адсорбентов использовали силикат натрия в качестве источника кремния, бромид цетилтриметиламмо-ния (Fluka) в качестве темплата и триметилбензол (Sigma-Aldrich) в качестве солюбилизатора.

Характеристики пористой структуры адсорбентов, приведенные в таблице 1, определяли из изотерм низкотемпературной адсорбции азота, полученных на поромере ASAP 2010N (Micromer-itics). На рис. 1 приведены кривые распределения объемов пор по их размерам исследованных адсорбентов.

Фермент. Использован лиофилизированный препарат ß-галактозидазы (LAC) из грибов Aspergillus oryzae (Sigma). Содержание белка в препарате 8% (по кумасси). Для определения активности фермента использовали 2-нитрофенил^^-галактопира-нозид. Реакцию гидролиза проводили в фосфат-цитратном буферном растворе (рН 4.5). Через определенные промежутки времени дозатором из реакционной смеси отбирали пробу и вносили ее

в пробирку с раствором 1М №2С03 для остановки каталитической реакции и проявления характерного окрашивания о-нитрофенола; о-нитрофе-нол определяли спектрофотометрически при X = = 420 нм.

Адсорбционные измерения. Адсорбцию фермента проводили при температуре 10°С из буферных растворов (рН 4.5). Навески адсорбента (10—50 мг) помещали в бюксы, добавляли раствор фермента и оставляли в холодильнике. Использовали растворы, концентрация препарата фермента в которых составляла 0.1—2 мг/мл (или 8—160 мкг/мл по белку). Периодически определяли активность фермента и рассчитывали величину адсорбции по разнице его содержания в опытных и контрольных образцах. Время адсорбции варьировали от

1 до 10 суток. Изменения активности фермента в контрольных растворах при этом не происходило.

Определение параметров уравнения Михаэлиса-Ментен. Для определения параметров уравнения Михаэлиса-Ментен использовали гетерогенные образцы, полученные адсорбцией В-галактозида-зы из ее растворов при концентрации препарата

2 мг/мл в течение суток. Навеска образца составляла 5 мг, концентрация субстрата 0.1—1.5 мМ. Параллельно проводили определение кинетических параметров и для фермента в растворе. Экспериментальные данные обрабатывали в координатах Лайнуивера—Берка.

Определение эффективной константы скорости адсорбции. Для определения эффективных констант скорости адсорбции В-галактозидазы экспериментальные данные по изменению концентрации фермента в зависимости от времени адсорбции обрабатывали в координатах кинетического уравнения первого порядка. Пример такой обработки приведен на рис. 2. Процесс адсорбции в данных условиях описывается кинетическим уравнением первого порядка, что позволило определить эффективные константы скорости процесса.

ад ^з

13

1 -

0^

2 -

ад ^з

1 -

АДСОРБЦИЯ р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

(а)

10

499

I6

25

50

75

100 С

^белка'

125 мкг/мл

10 -

г мг

5

2.0 ^ D [нм]

Рис. 1. Кривые распределения объемов пор по их размерам для исследованных адсорбентов: а — кремнезем со структурой 8БЛ-15 (1), алюмосиликат со структурой £>БЛ-15 (2), силохром (3); б — бипористый кремнезем (1), бипористый алюмосиликат (2).

1п С [мкг/мл] 5.0

25

50

75

С

белка

100 мкг/мл

50

100

150

т, ч

Рис. 2. Определение эффективной константы скорости адсорбции. Адсорбент — мезопористый кремнезем; т — время адсорбции.

40

1/С, мл/мг

Рис. 3. Изотермы адсорбции В-галактозидазы: а — время адсорбции 1 сутки; б — время адсорбции 5 суток; в — спрямление в координатах уравнения Ленг-мюра; 1 — кремнезем со структурой 8БЛ-15, 2 — алюмосиликат со структурой ¿БЛ-15, 3 — бипористый кремнезем, 4 — бипористый алюмосиликат, 5 — силохром; А — адсорбция.

2

0

0

0

0

0

Таблица 2. Эффективные константы скорости адсорбции

Адсорбент Dm^ нм ^эфф х с 1

Мезопористый кремнезем 3 1.7

Кремнезем SBA-15 9.5 3.6

Алюмосиликат SBA-15 20 5.7

Бипористый кремнезем 3 и 30 4.6

Силохром 75 35.2

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

На рис. 3 приведены изотермы адсорбции В-галактозидазы, полученные при временах адсорбции 1 и 5 суток. Вид изотерм меняется в зависимости от времени адсорбции и природы адсорбента. На всех адсорбентах кроме бипористых при адсорбции в течение суток (рис. 3а) получены 8-образные зависимости. Если время адсорбции увеличить до 5 суток, на этих адсорбентах получены типичные изотермы L-типа. Они хорошо спрямляются в координатах уравнения Ленгмюра (рис. 3в), что позволило определить предельные величины адсорбции (табл. 1).

Изотермы адсорбции на бипористом кремнеземе (кривая 3 на рис. 3а) и бипористом алюмосиликате (кривая 4 на рис. 3б) отличаются от изотерм адсорбции на других адсорбентах. Они представляют собой кривые с перегибом, что может свидетельствовать о наличии нескольких типов адсорбционных центров на поверхности. Эти изотермы также спрямляются в координатах Ленгмюра, давая два

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»