МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 1, с. 90-97
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 579.841.91
ADVENELLA KASHMIRENSIS SUBSPECIES METHYLICA PK1 - ФАКУЛЬТАТИВНЫЙ МЕТИЛОТРОФ ИЗ РИЗОСФЕРЫ ОСОКИ © 2015 г. М. Н. Порошина*, **, Н. В. Доронина*, 1, Е. Н. Капаруллина*, Ю. А. Троценко*
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Пущино **Пущинский государственный естественно-научный институт Поступила в редакцию 06.06.2014 г.
Из ризосферы осоки на территории национального парка Памуккале (Турция) выделен штамм (PK1) факультативных метилобактерий, использующих метанол в качестве источника углерода и энергии. Клетки — неподвижные грамотрицательные палочки, размножаются бинарным делением. Строгий аэроб, оксидазо- и каталазоположительный. Оптимум температуры для роста — 29°С, pH 8.0—8.5, концентрации NaCl — 0.5%, не растет при 2% NaCl. Реализует рибулозобисфосфатный путь С^ассимиля-ции. В жирнокислотном составе клеток преобладают 11-октадеценовая (18:1ю7) и цис-9-гексадеценовая (16:1ю7с). Доминирующие фосфолипиды — фосфатидилэтаноламин и дифосфатидилглицерин. Основной убихинон — Q8. Содержание Г + Ц в ДНК — 55.4 мол. % (7^). Секвенирование гена 16S рРНК штамма PK1 выявило принадлежность к роду Advenella: 98.8 и 99.2% сходства с типовыми штаммами A. ince-nata CCUG 45225T и A. kashmirensis WT001T, соответственно. Уровень ДНК—ДНК гомологии штамма PK1 с типовой культурой A. kashmirensis WT001T составил 70%. MALDI-анализ также показал их близкую кластеризацию, но RAPD-анализ установил отличия штамма PK1 от других представителей рода Advenella. На основании гено- и фенотипических свойств изолят PK1 отнесен к виду A. kashmirensis subsp. methyltea PK1 (VKM-B 2850 = DSM 27514) и является первым метилотрофным представителем рода Advenella.
Ключевые слова: Advenella, факультативный метилотроф, рибулозобисфосфатный путь.
DOI: 10.7868/S0026365615010115
Род Advenella, семейство Alcaligenaceae [1], был предложен Coenye с соавт. [2] для описания гра-мотрицательных палочковидных/кокковидных бактерий, растущих при 3% NaCl в среде и выделенных из различных клинических образцов (ветеринарных и взятых у людей). Позднее были описаны и реклассифицированы из рода Tetrathiobacter [3] в род Advenella [4] виды A. kashmirensis WT001T [3] и A. mimigardefordensis DPN7T [5], выделенные из садовой почвы и компоста. A. kash-mirensis WT001T является факультативным хемоли-тотрофом, использующим тетратионат и тиосульфат в качестве источников энергии, и растет при 6% NaCl. A. mimigardefordensis DPN7T также способен расти на соединениях серы, в отличие от A.faeciporci M-07T, выделенного из активного ила биореактора животноводческой фермы (Япония) [6] и выдерживающего до 4% NaCl в ростовой среде. Однако представители рода Advenella, способные к метило-трофному росту, ранее не были описаны.
1 Автор для корреспонденции (e-mail: doronina@ib-pm.pushchino.ru).
Уникальный природный объект в Турции — национальный парк Памуккале (пер. с турецкого — "Хлопковый замок"), включен в список Всемирного наследия ЮНЕСКО (1988). Данный комплекс включает систему террасных водоемов, образованных известковой породой — травертином, и 17 термальными источниками с температурой воды 35—100°С.
Цель данной работы — таксономическая и фи-зиолого-биохимическая характеристика первого метилотрофного представителя рода АйугпгНа, выделенного из ризосферы осоки, отобранной на территории Памуккале.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования и условия культивирования. Стерильно отобранный из водоема (37°С) на территории парка Памуккале корень осоки помещали в колбу Эрленмейера (750 мл) с 200 мл среды "К" и 0.5% (об/об) метанола [7]. После трех пассажей в течение 3 сут на качалке (180 об/мин) при 29°С суспензию накопительной культуры вы-
севали истощающим посевом на агаризованную ("Difco", США, 2%) среду "К" с метанолом. Отдельные колонии пересевали на скошенный агар, переносили в жидкую среду и вновь высевали на агаризованную среду. Реизолированную колонию метилобактерий пересевали на скошенный агар. Чистоту выделенной культуры проверяли световой и электронной микроскопией, а также по однородности колоний, выросших на агаризован-ных средах с метанолом или глюкозой/пептоном.
В качестве референтных штаммов при ДНК— ДНК-гибридизации, RAPD- и MALDI-анализах использовали коллекционные типовые штаммы A. kashmirensis WT001T и A. incenata CCUG 45225T, а также A. incenata 4GA2008.
Определение культуральных и физиолого-биохимических свойств изолята. При описании колоний, изучении морфологии и подвижности клеток штамм РК1 выращивали на агаризованных средах "К". Способность изолята восстанавливать нитраты анализировали при помощи API — тестов 20NE и в жидкой среде "К", где аммонийный азот был заменен KNO3 (1 г/л), после 1, 2 и 3 сут инкубации. Образование индола из триптофана определяли колориметрически, выращивая культуры на среде "К" с метанолом, заменой (NH4)2SO4 на KNO3 (1 г/л) и добавлением 0.1% (вес/об) L-трип-тофана, используя реактив Сальковского [8]. Калибровочную кривую строили со стандартными растворами индолилуксусной кислоты. Гидролиз крахмала оценивали по реакции с раствором Люго-ля после выращивания культуры на агаризован-ной среде "К" с добавлением 0.2% (в/об) растворимого крахмала. Наличие оксидазы определяли, используя 1% (в/об) раствор тетраметил-п-фени-лендиамин дигидрохлорида. Активность катала-зы выявляли, нанося 3%-ный раствор перекиси водорода на штрих культуры, выращенной на ага-ризованной среде.
Температурный диапазон роста и рост при различных величинах pH определяли, как описано ранее [9].
При изучении способности изолята использовать различные органические соединения в качестве источника углерода и энергии в минеральную среду вместо метанола вносили 0.3% (в/об) испытуемого вещества, инокулировали суспензией культуры, смытой с агаризованной среды "К", и инкубировали 14 сут на качалке при оптимальной температуре. Летучие вещества вносили в концентрации 0.5% по объему. Потребление ди-хлорметана определяли, как описано ранее [8].
Кроме того, для определения спектра используемых субстратов и выявления некоторых биохимических свойств исследуемого штамма использовали также API тесты 20E, 20NE ("Biomerieux", Франция), согласно инструкции фирмы-производителя.
Галотолерантность изолята определяли на жидкой среде "К", варьируя содержание NaCl от 0 до 3%.
Для определения способности культуры использовать различные источники азота в среду "К" вместо (NH4)2SO4 вносили эквимолярные по азоту количества тестируемых веществ. Потребность в витаминах и устойчивость к антибиоткам изучали, как описано ранее [10].
Электронную микроскопию проводили известными методами [11]. Энзимологический анализ проводили ранее описанными методами [12].
MALDI анализ. Для получения MALDI-спек-тра бактерий использовали MALDI-TOF Autoflex speed масс-спектрометр ("Bruker Daltonik GmbH", Германия) согласно описанной методике [13].
Хемотаксономический анализ проводили, выращивая культуры на среде с пептоном. Фосфо-липидный состав клеток определяли тонкослойной хроматографией [11].
Для анализа жирных кислот бактерии выращивали в оптимальных условиях и в экспоненциальной фазе отбирали 30 мг биомассы. Состав жирных кислот определяли на хромато-масс-спектрометре AT-5850/5973 Agillent Technologies (США) [11].
Выделение и анализ ДНК. ДНК выделяли с использованием набора ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep ("Zymo Research", США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Г + Ц состав ДНК определяли методом тепловой денатурации на спектрофотометре "Beckman DU-8B" (США) при скорости нагрева 0.5°С/мин. В качестве стандарта использовали ДНК Escherichia coli K-12. Уровень ДНК—ДНК-гомологии изолята и референтных культур определяли методом ДНК-ДНК реассоциации [14].
ПЦР-амплификацию проводили на ДНК-тер-моциклере MJ Mini ("BioRad", США). Ген 16S рРНК амплифицировали ПЦР, используя универсальные для 16S рДНК прокариот праймеры 27f: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' и 1492r: 5'-AAGGAAGGTGATCCAGCTCGT-3' [15].
Фрагмент гена mxaF (550 п.н.), кодирующего большую субъединицу классической пирролохи-нолинхинон (PQQ)-зависимой метанолдегидро-геназы грамотрицательных бактерий, амплифицировали, используя праймеры 1003f и 1561r, согласно ранее описанному протоколу [16].
RAPD-анализ (Random amplified polymorphic DNA) проводили, используя праймер OPQ6: GAGCGCCTTG, в режиме: 1 цикл — 95°С, 3 мин; 30 циклов — 95°С, 1 мин; 36°С, 1 мин; 72°С, 90 с; последний цикл — 72°С, 5 мин. Реакционная смесь (15 мкл) содержала: 10 мкл воды MQ, 2.2 мкл ПЦР буфера х10, 1 мкл (10—100 нг) геномной ДНК, смесь 0.2 мМ дНТФ, 4 мкмоль праймера и 1 Е Таq-ДНК-полимеразы.
Таблица 1. Жирнокислотный состав клеток изучаемых штаммов (% от общего содержания), выращенных на среде с пептоном
Жирные Штамм A. kashmirensis
кислоты PK1 WT001T
12:0 — 3.12
14:0 0.50 0.18
16:1ю7с и/или 15:0 iso 2-OH 29.20 28.02
16:1ro7t 0.6 —
16:00 17.30 21.69
14:0 3-OH и/или 16:1 iso I 5.20 10.13
17cyc 6.90 3.53
17:0 — 0.27
18:1ю7 31.30 28.31
18:00 1.60 1.86
16:0 3-OH 1.00 0.80
19cyc 6.40 —
19:0 cyc ro8c — 1.32
19:0 10 methyl — 0.18
20:1ro7c — 0.34
Неизвестно — 0.24
Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Выделение и очистку фрагментов ДНК из легкоплавкой агаро-зы проводили на колонках с использованием набора ZymoClean Gel DNA Recovery Kit D4002 ("Zymo Research", США), согласно инструкции фирмы-производителя. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили при помощи наборов Big-Dye® Terminator v1.1 и капиллярного анализатора ABI PRISM® ("Applied Biosystems", США).
Филогенетический анализ. Предварительный скрининг сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК исследуемых штаммов проводили как описано ранее [17].
Укорененное филогенетическое дерево строили по методу neighbor-joining (NEIGHBOR) в программе TREECON [18]. Эволюционное расстояние рассчитывали как число замен на 100 нук-леотидов. Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью "bootstrap-анализа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.