УДК 543.95:543.55:543.38
АЭРОБНЫЕ МЕТИЛОБАКТЕРИИ КАК ОСНОВА БИОСЕНСОРА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ДИХЛОРМЕТАНА
© 2013 г. Ю. В. Плеханова, Ю. Е. Фирсова, Н. В. Доронина, Ю. А. Троценко, А. Н. Решетилов
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАНПущино, Московская обл., 142290
e-mail: anatol@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 15.05.2012 г.
Клетки бактерий-деструкторов дихлорметана (ДХМ) иммобилизовали сорбцией на различных типах мембран, которые фиксировали на измерительной поверхности рН-чувствительного полевого транзистора. Наличие ДХМ в среде (0.6—8.8 мМ) вызывало изменение выходного сигнала транзистора, обусловленное появлением ионов H+ в среде в результате утилизации ДХМ метилобактери-ями. Из 4 штаммов метилобактерий — Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4, Methylobacterium ex-torquens ДМ17, Methylopila helvetica ДМ6 и Ancylobacter dichloromethanicus ДМ16 — наиболее высокая и стабильная активность в отношении деградации ДХМ выявлена у штамма M. dichloromethanicum ДМ4. Из 11 типов мембран для иммобилизации клеток в качестве оптимальных носителей выбраны нитроцеллюлозные мембраны типа Millipore и хроматографическая стеклобумага GF/A, позволяющие получать стабильные сигналы биосенсора в течение 2 нед. без замены биорецептора.
DOI: 10.7868/S0555109913020141
Широкое использование дихлорметана (ДХМ), некоторые области применения которого показаны на рис. 1, требует постоянного контроля за его содержанием в городских и индустриальных стоках. ДХМ относится к классу галогенированных производных метана и является распространенным загрязнителем окружающей среды [1—3]. Известно, что ДХМ обладает высокой токсичностью для млекопитающих, вызывает образование опухолей печени и легких у мышей и крыс [4], оказывает канцерогенное действие на эритроциты, печень и почки человека [5, 6].
ДХМ считается одним из основных загрязнителей воды и атмосферы, так как в атмосфере период его полураспада составляет 70 сут, а в водных средах около 700 лет [7, 8], поэтому, разработка высокочувствительных, экспрессных и простых по конструкции аналитических устройств, таких, как биосенсоры, для определения ДХМ в промышленных и городских стоках является актуальной задачей.
ДХМ эффективно утилизируется некоторыми видами метилотрофных бактерий. Первый этап утилизации ДХМ как источника углерода и энергии микроорганизмами заключается в гидролитическом дегалогенировании с образованием формальдегида и неорганического хлорида. Реакция катализируется дихлорметандегалогеназой [9]:
дихлорметан-
СН2С12 + Н20 —дег"аза ) НСНО + 2НС1.
^ ^ ^ ЬЬИ
Этот процесс у аэробных метилобактерий, использующих ДХМ в качестве источника углерода
и энергии, сопровождается образованием в цитоплазме высоких концентраций НС1. При этом ионы Н+ и С1- экскретируются в среду [10].
Процесс биодеструкции ДХМ обычно оценивают с помощью газовой хроматографии [11], с использованием радиоизотопов [12], а также спек-трофотометрически по концентрации ионов хлора в культуральной жидкости [13]. Известен также биосенсор для определения ДХМ [14], основанный на комбинации преобразователей, состоящий из проточного калориметра и электрода, чувствительного к ионам хлора. Анализ основан на использовании клеток НурНот1сгоЫит ЭЫ2, иммобилизованных в альгинат.
Поскольку при биодеградации ДХМ в среду выделяются не только ионы хлора, но и протоны, этот процесс можно отслеживать с помощью рН-чувствительных полевых транзисторов (ПТ) [15, 16]. Миниатюрные ПТ часто применяют в качестве электрохимических преобразователей сигналов биосенсоров для детекции различных токсичных соединений, например пестицидов (атразин [17], 2,4-Д [18]), токсинов ф-бунгаротоксин из яда змеи BungarusтиШст^т [19]). Известно применение полевых транзисторов, содержащих алко-гольоксидазу и клетки метилотрофных дрожжей Натепи1а ро1утогрка для определения формальдегида [20]. Применение полевых транзисторов для определения дихлорметана неизвестно.
Цель работы — создание биосенсора на основе полевого транзистора с иммобилизованными на нем клетками метилотрофных деструкторов ДХМ
В качестве хладагента (фреон-30, хладон-30)
Входит в состав аэрозолей
В производстве термопластиков, синтетических волокон, фотопленки
Удаление широкого спектра лакокрасочных покрытий
Для экстракции чувствительных к нагреванию веществ (пищевые жиры,кофеин)
Растворитель для химического синтеза в фармацевтической промышленности
Рис. 1. Области применения дихлорметана.
для детекции ДХМ в лабораторных условиях и изучение параметров биосенсорного анализа.
МЕТОДИКА
Реагенты. В качестве иммобилизационных материалов в экспериментах использовали хромато-графическую стеклобумагу GF/A ("Whatman", Великобритания); нитроцеллюлозные мембраны Millipore с различным размером пор ("Sigma", США, размер пор 0.22, 0.30, 0.45 и 0.65 мкм); регенерированную целлюлозу на полипропилене (размер пор ~500 А), полисульфонамид на лавсане (размер пор ~1000 А), полиэфирсульфон на лавсане (размер пор ~0.22 мкм), ацетат целлюлозы на тканевом лавсане (размер пор ~1000 А), которые получены на ЗАО ТНЦ "Владипор" (Россия); нетканые материалы — термоскрепленный полипропилен ТС-1 и ТС-2 (ОАО "НИИ нетканых материалов", г. Серпухов, Моск. обл., Россия). В качестве компонентов измерительной среды использовали хлорид натрия, натрий фосфорнокислый двузамещенный, натрий фосфорнокислый однозамещенный ("Диакон", Россия), дихлорметан ("Синтакон", Россия).
Рецепторный элемент биосенсора. Для приготовления рецепторного элемента биосенсора использовали суспензии клеток аэробных деструкторов ДХМ: Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4 ВКМ В-2191 (=DSM 6343), Methylopila helvetica ДМ6, Ancylobacter dichloromethanicus ДМ16 ВКМ В-2484 (=DSM 21507) и Methylobacterium ex-torquens ДМ17. Штаммы выделены из мест с длительным селективным давлением поллютанта: из загрязненного грунта и ила очистных сооружений химических предприятий Швейцарии, Германии и России.
Бактерии выращивали на среде "К", содержащей (г/л): KH2PO4 - 2.0, (NH4)2SO4 - 2.0, NaCl -
0.5, MgSO4 • 7H2O - 0.025, FeSO4 • 7H2O - 0.002, рН 7.2. Культивирование на ДХМ проводили в колбах Эрленмейера объемом 300 мл, содержащих 50 мл среды, закрытых завинчивающимися крышками с резиновой мембраной ("Precision Sampling Corp.", Baton Rouge, США) при 29°С на качалке (180 об/мин). ДХМ вносили в среду через мембрану шприцем порциями до конечной концентрации 10 мМ. По мере сдвига pH до 5.0 добавляли 3.0 M NaOH до pH 7.0. Для культивирования A.. dichloromethanicus ДМ16 в стерильную среду "К" добавляли биотин и пантотенат (20 мкг/л).
Выращенные таким образом клетки с индуцированной дихлорметандегалогеназой центрифугировали при 10000 g в течение 3 мин, промывали дважды калий-фосфатным буфером и затем разбавляли исходный объем клеток в два раза таким же буфером; 5 мкл суспензии клеток наносили на мембрану, имеющую размер 3 х 3 мм2 и подсушивали на воздухе в течение 10-15 мин. Затем мембрану закрепляли с помощью фиксатора на поверхности измерительного электрода, которым являлся ПТ.
Преобразователь сигнала биосенсора. В работе использовали ПТ, изготовленные на НПО "Позитрон" (г. Санкт-Петербург, Россия. рН-чув-ствительной мембраной служил слой пятиокиси тантала на затворной области ПТ. Химическая чувствительность ПТ составляла 45-56 мВ/рН. После усиления сигнал поступал на компьютер для регистрации и обработки данных. Измеряемым параметром являлась амплитуда сигнала ПТ. Измерения выполняли в стеклянной кювете объемом 2.0 мл при постоянном перемешивании и температуре 20-22°С в натрий-фосфатном буфере (pH 7.2, 1 мМ).
Оценка диффузионной проницаемости мембран.
Фрагменты мембран помещали на затворную pH-
АЭРОБНЫЕ МЕТИЛОБАКТЕРИИ КАК ОСНОВА БИОСЕНСОРА
205
чувствительную область транзистора, регистрировали базовый уровень сигнала затем добавляли 10 мкл 0.1 М HCl (конечная концентрация в кювете 0.5 мМ). Регистрировали время от внесения вещества до начала развития сигнала и скорость изменения сигнала, коррелирующие со скоростью диффузии протонов в данном материале.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Скрининг штаммов метилобактерий по интенсивности биодеградации ДХМ. На рис. 2 представлены калибровочные зависимости, позволяющие определять ДХМ с помощью метилобактерий M. dichloromethanicum ДМ4, M. extorquens ДМ17, M. helvetica ДМ6, A. dichloromethanicus ДМ16, использующих ДХМ в качестве источника углерода и энергии сериновым (ДМ4, ДМ17, ДМ6) или рибулозобисфосфатным (ДМ16) путями С1-метаболизма. Калибровочные зависимости для четырех штаммов микроорганизмов описываются уравнениями, представленными в табл. 1. Основные характеристики биосенсоров, вычисленные на основании этих зависимостей, показаны там же. Область линейности, соответствующее уравнение регрессии и коэффициент вариации вычислены с помощью программы Microsoft Office Excel 2003.
Для создания биосенсора лучшие характеристики выявлены у штамма M. dichloromethanicum ДМ4. Штамм характеризовался высокой активностью в отношении деградации ДХМ и устойчивостью к различным факторам окружающей
10
ДХМ, мМ
Рис. 2. Калибровочные зависимости для определения ДХМ с помощью различных штаммов микроорганизмов: 1 — Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4; 2 — Methylopila helvetica ДМ6; 3 — Methylobacterium extorquens ДМ17; 4 — Ancylobacter dichloromethanicus ДМ16. Ось Y — сигнал биосенсора.
среды: ультрафиолетовому излучению, пероксиду водорода, колебаниям рН и температуры, высушиванию [21]. Кроме того, клетки этого штамма хорошо иммобилизовались на носителях и не утрачивали способности к деградации поллю-танта при длительном культивировании в неселективных условиях, что связано с хромосомной локализацией соответствующих генов [22].
Таблица 1. Основные характеристики биосенсоров на основе разных бактериальных штаммов — деструкторов ДХМ
Характеристика
Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4
Methylopila helvetica ДМ6
Methylobacterium extorquens ДМ17
Ancylobacter dichloromethanicus ДМ16
Уравнение, описывающее калибровочную зависимость
Линейный диапазон детекции, мМ
Уравнение регрессии для линей
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.