ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 2, с. 111-121
УДК 579.2:579.6+577.1
АЭРОБНЫЕ МЕТИЛОБАКТЕРИИ - ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ОБЪЕКТЫ СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ (ОБЗОР)
© 2015 г. Н. В. Доронина, М. Л. Торгонская, Д. Н. Федоров, Ю. А. Троценко
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл., 142290
e-mail: doronina@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 29.09.2014 г.
Обобщены экспериментальные данные последнего десятилетия о метаболических особенностях аэробных метилобактерий и перспективах их использования в различных сферах современной биотехнологии, в том числе с применением методов генной инженерии.
Ключевые слова: аэробные метилобактерии, биотехнология, полигидроксиалканоаты, эктоин, фи-тосимбионты, биоаналитика, биодеградация, биоремедиация.
DOI: 10.7868/S0555109915020051
Аэробные метилобактерии, использующие окисленные и замещенные производные метана в качестве источников углерода и энергии, широко распространены в природе и участвуют в биосферных циклах превращения углерода, азота, фосфора и других биогенных макро- и микроэлементов. Метилобактерии являются важным звеном в цепи метаболических превращений летучих Сгсоединений и своеобразным биофильтром на их пути в тропосферу, уменьшающим опасность истощения озонового слоя Земли.
Сгсоединения существенно различаются по физико-химическим свойствам, что определяет особенности биологии и метаболизма метилобак-терий. Известно около 50 родов аэробных метилобактерий, относящихся ка-, в- и у-классам Рго1еоЬас1епа и реализующих сериновый, рибуло-зомонофосфатный (РМФ) или рибулозобисфос-фатный (РБФ) пути Сгассимиляции [1—2]. Способность аэробных метилобактерий осуществлять трансформацию С1-соединений и биосинтез ценных метаболитов определяет интерес к изучению их структурно-функционального разнообразия и перспектив практического применения. Этому способствует создание фондов детально охарактеризованных культур во всероссийской (ВКМ), немецкой (DSMZ), японской ^СМ), шведской (ССиО) и английской (КС1МБ) коллекциях микроорганизмов. С развитием и активным внедрением в начале 2000-х годов молекулярно-биологиче-ских методов появилась реальная возможность выйти на новый уровень понимания феномена метилотрофии. К настоящему времени секвени-рованы геномы целого ряда метилобактерий. Определение геномных последовательностей метилобактерий позволяет реконструировать их
метаболические модули и функциональные сегменты (метаболомы), полнее оценить их адаптивный и биотехнологоический потенциал, повысить эффективность процессов биосинтеза и биодеградации.
Метилобактерии — продуценты биодеградабель-ных и биосовместимых пластиков. Считается, что полиэтилен, полипропилен и поливинилхлорид, составляющие более 40% бытового мусора, не подвергаются биодеградации, хотя и существуют отдельные сообщения о возможности их медленного разложения в природе [3]. Для решения глобальной экологической проблемы утилизации пластмассовых изделий актуальна разработка способов производства биодеградируемых полимеров для нужд промышленности, медицины, сельского хозяйства и нанотехнологий. В этой связи большой научно-практический интерес представляют возобновляемые, биосовместимые и чрезвычайно универсальные термопластики — полигидроксиалканоаты (ПГА), которые являются единственными доступными водонепроницаемыми материалами, полностью биоразлагаемыми в аэробных и анаэробных условиях [4—5]. В зависимости от количества углеродных атомов в мономере ПГА классифицируются на короткоцепочечные (С < 5), среднецепочечные (6 < С < 14) и длинно-цепочечные (С > 15) [5—6].
К наиболее распространенным короткоцепо-чечным ПГА относится поли-в-гидроксибутират (ПГБ). Показано, что продуцентами ПГБ и его сополимера с в-гидроксивалератом (ПГБ/В) могут служить аэробные метилобактерии с серино-вым и рибулозобисфосфатным путями С1-мета-болизма [2]. При этом наиболее высокий уровень синтеза ПГБ характерен для метилобактерий с се-
риновым путем, которые при росте на метаноле способны накапливать 40—80% биополимера от веса сухой биомассы [2, 7].
Известно, что биосинтез ПГБ у бактерий является способом адаптации к действию различных физиологических стрессоров, связанных с недостатком NH4, HPO4-, Mg2+, so4- , и K+, а также повышенной кислотностью, соленостью среды и температурными изменениями [8—12]. Обнаружено, что у экстремофильных бактерий мономер ПГБ функционирует как химический шаперон, предотвращая агрегацию белков и стабилизируя ферменты, вследствие этого он был отнесен к атипичному классу осмолитов — пьезолитам [11, 13].
В синтезе ПГБ метилобактериями с серино-вым путем Q-метаболизма участвуют Р-кетотио-лаза (PhaA, КФ 2.3.1.9) и ацетоацетил-КоА редук-таза (PhaB, КФ 1.1.1.36), которые катализируют также две первые реакции недавно открытого этилмалонатного цикла регенерации глиоксилата [14—16]. Гены phaA и phaB у Methylobacterium ex-torquens образуют кластер вместе с регуляторным геном phaR, продукт которого, по-видимому, осуществляет контроль потоков ацетил-КоА на синтез ПГБ или С1-ассимиляцию. ГенphaC, кодирующий ПГБ-синтазу (КФ 2.3.1.В2), локализован у M. extorquens отдельно и, по-видимому, регулируется независимо от генов phaAB [14].
Было изучено влияние увеличения копийно-сти генов биосинтеза ПГБ на свойства биополимера у метилобактерии M. extorquens G10. Показано, что при введении в клетки штамма-продуцента дополнительных копий генов phaC и phaCAB происходило увеличение активности ПГБ-синта-зы и двукратное снижение молекулярной массы (Мм, 150 ^ 79 кДа) синтезируемого ПГБ, при этом физико-химические свойства биопластика изменялись незначительно [17]. Известно, что значение Мм является важным показателем для дальнейшего промышленного применения ПГБ и его снижение нежелательно [4].
Природа углеродного субстрата может оказывать влияние на величину Мм синтезируемого ПГБ. Так, при культивировании M. extorquens и неметилотрофного продуцента Ralstonia eutropha на глицерине, метаноле и этаноле Мм продуцируемого ПГБ была ниже, чем при культивировании на сукцинате, глюкозе или фруктозе. Оказалось, что глицерин способен вызывать терминацию цепи при синтезе ПГБ, однако исследования на ре-комбинантных штаммах Escherichia coli продемонстрировали возможность получения ПГБ с высокой Мм и на глицерине при использовании подходящих штаммов и условий культивирования [4].
При выращивании на метаноле ряд штаммов аэробных метилобактерий способен синтезировать ПГБ с различной Мм. Так, Мм ПГБ M. ex-
torquens составляла 50—200 кДа, тогда как Methylo-ligella halotolerans С2 продуцировал высокомолекулярный полимер ~3000 кДа [18]. Существенные различия свойств биополимеров, синтезируемых метилобактериями, свидетельствуют о физиолого-биохимических особенностях этих продуцентов, и могут быть, в частности, обусловлены разной про-цессивностью их ПГБ-синтаз.
Использование таких дешевых источников углерода, как метанол, этанол или глицерин, снижает себестоимость биотехнологического производства ПГБ [4, 5, 10]. При этом особенно важно, что аэробные метилобактерии могут использовать не только чистый метанол, но и метанол-сырец [18]. Недавно появилось сообщение о синтезе ПГБ и других ПГА штаммом Methylobacterium or-ganophilum CZ-2 при биодеградации метана с добавлением в качестве косубстратов цитрата или пропионата [19].
Одной из проблем биотехнологического производства ПГА является энергоемкость. Снизить затраты на стерилизацию, аэрацию, перемешивание и последующие стадии очистки продуктов призвано создание рекомбинантных штаммов-продуцентов со сверхэкспрессией генов, способствующих выживанию бактериальных клеток в экстремальных промышленных условиях. У таких штаммов подавляется филаментация клеток, снижается потребность в кислороде, повышается потребление источников углерода, перенаправляются метаболические пути, и изменяется регуляция редокс-состо-яния в пользу функционирования цикла Кребса для эффективной продукции восстановительных эквивалентов в микроаэробных условиях [4]. Поскольку продукция ПГБ розовоокрашенными представителями рода Methylobacterium требует очистки биополимера от каротиноидного пигмента, перспективным для снижения стоимости процесса оказался бесцветный мутант M. extorquens G10-W с дефектом по гену фитоендесатуразы (КФ 1.3.99.26—31) аИ, не отличавшийся по скорости роста и уровню накопления ПГБ от исходного штамма G10 [17].
Другое актуальное направление при изучении биосинтеза ПГА связано с улучшением физико-химических свойств полимеров. Например, введение Р-гидроксивалерата в ПГБ понижает температуру плавления биопластика. При этом увеличивается разница между температурами плавления и термического разложения, повышается его эластичность и прочность.
Для биосинтеза сополимеров ПГА в основную среду для выращивания добавляют косубстраты, например для ПГБ/В — пентанол. Показано, что увеличение концентрации пентанола до 20% в смеси с метанолом стимулировало у M. extorquens G10 биосинтез ПГБ/В с Мм ~1500 кДа и содержанием валерата до 50%, особенно при добавлении косубстрата в логарифмической фазе роста куль-
туры. Однако высокие концентрации пентанола, токсичные для продуцента, уменьшали общий выход ПГБ/В. Повышение Мм ПГБ/В до 1500 кДа снижало температуру плавления биополимера с 172 до 162°С и степень кристалличности с 63 до 8%, но повышало эластичность биопластика [7].
В последнее десятилетие все большее внимание уделяется функционализованным ПГА (ФПГА), следующему поколению биополимеров. Введение функциональных групп в биополимеры существенно улучшает их физико-химические свойства и расширяет сферы их потенциального применения. Большинство синтезированных ФПГА относятся к среднецепочечным и характеризуются каучукопо-добными механическими свойствами и низкой температурой плавления (<100°C). Поскольку субстраты с реактивными группировками токсичны и дороги, ФПГА производятся путем химической модификации биополимеров с концевыми двойными связями. В свою очередь, синтез ПГА, содержащих двойные связи, осуществляется штаммами-продуцентами рода Pseudomonas при добавлении в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.