МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 5, с. 868-872
КРАТКОЕ ^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЕ
УДК 577.29
АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ И ПРОТЕОМНЫЙ СКРИНИНГ КАК ЭФФЕКТИВНЫЙ МЕТОД ПОИСКА БЕЛКОВ-МИШЕНЕЙ
ДЛЯ БЕЛКА S100A4 © 2014 г. Ю. А. Кошелев*
Государственный научный центр "Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна" Федерального медико-биологического агентства России, Москва, 123182 Поступила в редакцию 27.03.2014 г. Принята к печати 22.05.2014 г.
Аффинная хроматография с последующей идентификацией селективно связавшихся белков может служить эффективным способом обнаружения новых биологически значимых молекулярных взаимодействий. При оптимизации данного метода необходимо учитывать структуру молекулы, ее поверхностный заряд, а также возможность регулирования конформационных изменений, влияющих на гидрофобные свойства ее поверхности. Используя данный метод, мы идентифицировали новые белки-мишени для белка S100A4, среди которых оказались белки цитоскелета Sept2, Sept7, Septll и транскрипционный кофактор Ddx5. Взаимодействие с септинами могло бы объяснить механизм влияния белка S100A4 на увеличение подвижности клетки, а с кофактором Ddx5 — механизм регулирования уровня экспрессии таких генов, как гена Е-кадгерина, р21 ( Waf1/Cip1), Bnip3 и других. Предложенный протокол может быть применим для поиска белков-мишений других членов семейства Sl00, молекулы которых имеют высоко гомологичную первичную и пространственную структуры.
Ключевые слова: S100A4, аффинная хроматография, структура молекулы, протеомный анализ.
AFFINITY CHROMATOGRAPHY AND PROTEOMIC SCREENING AS THE EFFECTIV METHOD FOR S100A4 NEW PROTEIN TARGETS DISCOVERY, by Y. A. Koshelev* (State Research Center "Bur-nasyan Federal Medical Biophysical Center" of Federal Medical Biological Agency (SRC-FMBC), Moscow 123 098 Russia. *e-mail: yakoshelev@mail.ru). Affinity chromatography fallowed by a selective binding proteins identification can be using as effective method for a biological impotent interactions discovery. The molecular structure and their surface charge as and conformational regulation possibilities, which change their surface hydrophobic properties, all they should to taken in account during method optimization process. With the same method we had identify some new S100A4 target proteins such as cytoskeleton proteins Sept2, Sept7, Septll and this interaction would can to highlight as S100A4 would regulate cell motility. Even we had identify the transcription cofactor Ddx5 and through such complex formation a S100A4 protein would can to regulate Е-cadherin, f21 Waf1/Cip1), Bnip3 gene expression. The same protocol can be using for a target proteins search with another S100 protein family members, because their molecules demonstrate a high homology level in amino aside sequences and 3D structures.
Keywords: affinity chromatography, S100A4, molecular structure, proteomic screening.
DOI: 10.7868/S0026898414050073
Белок 8100Л4 известен в качестве маркера высокого метастатического потенциала опухолевых клеток [1, 2] и относится к семейству 8100. В него входят 25 небольших молекул (10—12 кДа) с гомологичной вторичной структурой, связывающие ионы кальция и образующие нековалентные параллельные гомодимеры [3]. Они не обладают
* Эл. почта: yakoshelev@mail.ru
собственной ферментативной активностью или способностью узнавать определенные последовательности РНК и ДНК, но выполняют различные функции, регулируя активность других белков внутри и вне клетки. Белок 8100Л4 обильно представлен в цитоплазме, он способен перемещаться в ядро клетки и регулировать экспрессию таких
АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
важных генов, как ген Е-кадгерина, [4] р21 Wafl/Cipl), Bnip3 [5] и других. При исследовании молекулярных механизмов действия S100A4 на клеточный фенотип необходимо найти белки-мишени, для чего используются различные методы первичного скрининга. Мы применяли методы аффинной хроматографии, оптимизированной для изучения структуры и свойств молекулы S100A4, и протеомного скрининга для поиска новых белков-мишений в клетках аденокарциномы молочной железы мышей линии CSML-100.
Для приготовления аффинного сорбента использовали вектор на основе плазмиды pQE-31, содержащий кДНК белка S100A4 с шестью гисти-диновыми кодонами на N-конце (любезно предоставлен Е.М. Луканидиным). Ген белка экспрес-сировали в штамме E. coli XL1 Blue и очищали на металлохелатном матриксе — агарозе Ni-NTA ("Qiagene Ltd.", Германия), согласно протоколу, рекомендованному фирмой. Очищенный белок кова-лентно присоединяли к BrCN-сефарозе 4В ("Farmacia", Швеция) при концентрации 2—4 мг на 1 мл активированного матрикса в 0.1 М фосфатном буфере (рН 8.0), содержащем NaCl (0.6 М) и Tween 20 (0.1%), в течение 1—2 ч при 25°C. Не прореагировавшие активные группы матрикса инактивировали о-метилглицином (0.2 М) в том же буфере, к которому добавляли Р-меркаптоэта-нол (1мМ ), в течение ночи при 8°C. Полученный матрикс промывали высокосолевым буфером (50 мМ ацетат натрия, рН 4.2, содержащим 0.6 М хлорид натрия, 0.1% Tween 20, 5 мМ Р-меркапто-этанол), а затем другим буфером (50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, содержащим 0.6 М хлорид натрия, 0.1% Tween 20, 5 мМ Р-меркаптоэтанол, 0.02% азид натрия,). В этом буфере аффинный сорбент хранили до использования при 4°C.
Аффинную хроматографию белков на S100A4-се-фарозе проводили в следующих условиях. 300 млн клеток линии CSML-100 (карциносаркома молочной железы мыши) обрабатывали ультразвуком на льду в течение 2 мин в 50 мМ имидазольном буфере (рН 7.5), содержащем также Тритон-Х100 (0.1%), Tween-20 (0.1%), NaCl (150 мМ), сахарозу (0.45 М), Р-меркаптоэтанол (5 мМ) и коктейль ингибиторов протеаз ("Sigma", США). Остатки клеток осаждали центрифугированием при 15000 об./мин в течение 10 мин. К супернатанту добавляли хлорид кальция до конечной концентрации 10 мМ, и после инкубации (8°C, 30 мин) фрагменты внутриклеточных мембран осаждали (15 мин, 10000 g), а остальные мембранные везикулы удаляли из супер-натанта при 80000 g, 1ч. Супернатант инкубировали с S100A4-сефарозой и контрольным матриксом в течение 1 ч. Контрольный (на отсутствие спонтанной агрегации белков в процессе проведения
И ПРОТЕОМНЫЙ СКРИНИНГ 869
хроматографии) матрикс представлял собой равную по объему аликвоту активированной BrCN-сефа-розы, в которой активные группы были инакти-вированы тем же раствором, что и на аффинном сорбенте, но белок к этому матриксу не пришивали. Все указанные выше процедуры выполняли при 8°C. Далее контрольную и опытную колонки (предварительно уравновешенные таким же буфером) промывали 30 мМ имидазольным буфером (рН 7.5), содержащим также Tween-20 (0.1%), NaCl (200 мМ), Р-меркаптоэтанол (2 мМ), хлорид кальция (10 мМ), в соотношении 50 объемов буфера к общему объему матрикса. Затем белки последовательно элюировали с колонок порциями того же буфера, к которым добавляли или 0.5 M NaCl, или 0.5 №С1с 40 мМ ЭДТА, или 2-пропанол до 30%. В буфере, содержащем 2-пропанол, с аффинного сорбента элюировались остальные белки (в незначительных количествах), и сорбент хранили в этом буфере при 8°C до следующего цикла хроматографии.
После диализа и концентрирования на ячейках фирмы "Amicon" (США) элюаты анализировали методом электрофореза по Лэммли в полиа-криламидном геле различной плотности. Белки, селективно связавшиеся с аффинным матриксом, подвергали масс-спектрометрической идентификации при помощи метода пептидного фингерприн-тинга. Пептидные спектры анализировали, используя программу MASCOT (www.matrixsciense.com). Все экспериментальные процедуры, кроме подробно описанных в данном разделе, могут быть выполнены по стандартным протоколам.
Основные результаты, полученные с ипользо-ванием предложенного выше протокола, приведены далее. Материал, полученный при элюции буфером, содержащим 40 мМ EDTA, подвергали электрофорезу в градиентном (7—12%) ПААГ (рисунок), и видимые после окрашивания белки, указанные стрелками на рисунке, идентифицировали при помощи масс-спектрометрического метода пептидного фингерпринта с использованием трипсинолиза. Пептидные спектры анализировали, используя программу MASCOT. Для всех спектров интегральный скор-параметр, ниже которого вероятность случайного совпадения былар < 0.05, составляет 79 баллов.
Из мажорных белков были определены четыре белка цитоскелета.
1) Белок gi|6754816, септин 2 (Sept2 /Nedd5) Mr 41499 Да. Перекрывание последовательности пептидами из полученного масс-спектра составило 61%, интегральный скор-параметр 180.
2) Белок gi|28173 550, септин 7 (Sept7/cdc10), Mr 50617 Да. Перекрывание последовательности
870
КОШЕЛЕВ
ТЦНМ IIA
Hsp70
Ddx5
Septll Sept7 Sept2
1 2
Электрофорез белков в градиентном полиакриламидном геле (7—12%), элюированных буфером, содержащим EDTA, с контрольного и аффинного матриксов. 1 и 2 — элюаты с контрольного и аффинного матрикса соответственно (окраска Кумасси R-250). Стрелками указаны идентифицированные белки. Подробное описание дано в тексте.
пептидами из полученного масс-спектра составило 54%, интегральный скор-параметр 165.
3) Белок gi|57634518, септин 11 (Septll), Mr.49310 Да. Перекрывание последовательности септина 11 пептидами из полученного масс-спектра составило 51%, интегральный скор-параметр 160.
Эти три белка образуют в цитоплазме фила-менты состава Sept2/7/11, состоящие из гексаме-ров при их соотношении 2 : 2 : 2 — для каждого мономера внутри гексамера.
4) Белок gi|114 326446, тяжелая цепь немышечного миозина типа IIA (ТЦНМ) Mr 226217 Да, интегральный скор-параметр 169. Это давно известная мишень белка S100A4, и их взаимодействие детально охарактеризовано на молекулярном уровне [6].
5) Белок gi|83 816 893 p68/Ddx5, РНК-хеликаза, содержащая DEAD-бокс (box contaning RNA heli-cases), интегральный скор-параметр 110. Этот белок является также транскрипционным кофактором для различных промоторов.
6) Белок gi|74188814 Hsp70, Mr 72305 Да, интегральный скор-параметр 188. Это известный бе-лок-шаперон, способный, как показано ранее [7], взаимодействовать с широким спектром молекул,
в число которых входит и S100A4. В да
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.