БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 2, с. 166-169
УДК 577.113.6;577.112.083;612.017.3
АФФИННЫЕ СОРБЕНТЫ НА ОСНОВЕ ДНК-АПТАМЕРОВ ДЛЯ СОРБЦИИ ^ ЧЕЛОВЕКА
© 2014 г. В. А. Спиридонова*, П. А. Левашов**, ***, #, Е. Д. Овчинникова**, О. И. Афанасьева**, К. А. Глинкина***, И. Ю. Адамова**, С. Н. Покровский**
*Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 40 **ФГБУ "Российский кардиологический научно-производственный комплекс"Министерства здравоохранения РФ
Москва, 3-я Черепковская ул, д. 15А ***Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 3 Поступила в редакцию 05.09.2013 г. Принята к печати 13.10.2013 г.
Для сорбции 1§Б из плазмы крови человека синтезированы три аффинных сорбента на основе по-лисахаридной матрицы с использованием ДНК-аптамеров в качестве лигандов. Сорбенты показали высокую сорбционную эффективность: в зависимости от ориентации ДНК-аптамеров на матрице экспериментальные значения констант сорбции 1§Б составили 0.11—0.17 нМ. Показана стабильность разработанных аффинных сорбентов при многократном использовании и подобраны условия их регенерации.
Ключевые слова: ДНК-аптамеры, иммуноглобулин Е, аффинный сорбент.
БОТ: 10.7868/80132342314020122
ВВЕДЕНИЕ
Повышенный уровень 1§Б в крови человека связан с развитием различных патологий и наблюдается, в частности, при аллергических реакциях, ато-пическом дерматите, аллергической астме [1—6]. Во многих случаях медикаментозная терапия недостаточно эффективна при лечении этих заболеваний и поэтому настоящее время применяют методы экстракорпоральной терапии, в том числе удаление 1§Б с помощью аффинных сорбентов [7—9].
В последнее десятилетие активно развивается направление по созданию высокоспецифичных лигандов — целевых фрагментов нуклеиновых кислот, называемых аптамерами и способных высоко-аффинно связываться с различными белковыми биополимерами. В настоящее время ДНК/РНК-аптамеры получены для связывания различных белков — мишеней. Константа диссоциации таких комплексов при удачном выборе аптамера может достигать уровня 10—50 нМ [10, 11]. Создан сорбент на основе аптамера для связывания аутоанти-тел к в1-адренорецептору [12]. Такой подход может представлять серьезную конкуренцию технологиям, в которых для избирательного связывания биополимеров используются аффинные носители с антителами к сорбируемому веществу в качестве
# Автор для связи (эл. почта: levashov@yahoo.com).
лигандов. Более того, в отличие от антител, апта-меры как правило неиммуногенны [13] и поэтому в технологиях терапевтического афереза носители с ковалентно иммобилизованной ДНК могут более широко использоваться. ДНК-аптамеры, связывающие 1§Б человека, в настоящее время широко используются в тест-системах [14—17]. Целью данной работы было выяснение возможностей использования аптамеров к 1§Б в качестве лигандов для получения аффинных сорбентов медицинского и биотехнологического назначения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В работе исследованы следующие производные ДНК-аптамеров, специфичные для 1§Б [10]: NH2-(С6H12)-GG-GGC-ACG-TTT-ATC-CGT-CCC-TAG-TGG-CGT-GCC-CC-iT (1); GGG-GCA-CGT-TTA-TCC-GTC-CCT-AGT-GGC-GTG-CCC-C-(С6Hl2)-NH2 (2); N^-^12)^-GGC-ACG-TTT-ATC-CGT-CCC-TCC-TAG-TGG-CGT-GCC-CC (3). Гексиламинпроизводные аптамеров были синтезированы твердофазным амидофосфитным методом, затем были ковалентно присоединены к полимерной матрице на основе агарозы через алифатическую аминогруппу, наиболее реакционноспособную в условиях иммобилизации. Синтезированные сорбенты с использовани-
Характеризация синтезированных аффинных сорбентов на основе ДНК-аптамеров (1), (2) или (3). Концентрация компонентов в исходной плазме: общий белок — 66.9 мг/мл, IgG — 10.4 мг/мл, ^Б — 1.0 мкг/мл
IgE IgG Общий белок
сорбционная емкость, мкг на 1 мл геля удаление из плазмы, % сорбционная емкость, мг на 1 мл геля удаление из плазмы, % сорбционная емкость, мг на 1 мл геля удаление из плазмы, %
1.6 ± 0.5 16 ± 5 2.4 ± 0.3 2.3 ± 0.3 4.9 ± 0.9 0.7 ± 0.1
4.9 ± 0.6 49 ± 6 3.0 ± 0.4 2.9 ± 0.4 5.9 ± 1.1 0.9 ± 0.2
4.8 ± 0.5 48 ± 5 2.9 ± 0.4 2.7 ± 0.4 6.8 ± 1.2 1.0 ± 0.2
ем этих производных аптамеров в качестве лиган-дов соответственно обозначены номерами (I), (II) и (III). Производное аптамера (1) отличается наличием на свободном конце инвертированного нук-леотида (iT), который был введен для возможной защиты от деградации ДНК азами. Производное аптамера (3) отличается производных (1) и (2) положением алифатической аминогруппы в своем составе, которая введена со стороны З'-конца. Количество иммобилизованного лиганда составило 0.9 ± 0.1 нмоль на 1 мл геля; 1.0 ± 0.1 нмоль на мл геля и 0.9 ± 0.1 нмоль на мл геля для сорбентов I, II и III соответственно.
Для определения емкости синтезированных аффинных сорбентов (I), (II) и (III) по отношению к IgE и определения параметров последующего снятия белка проведена серия хроматогра-фий. Емкость носителя определяли без элюции по разнице количеств иммуноглобулинов и общего белка для исходных препаратов и препаратов после хроматографии (проскоков) с учетом разведения растворов. Для проверки возможности многократного использования сорбентов регенерацию сорбентов проводили буферной смесью 0.2 М глицин—HCl pH 2.5. Результаты этих измерений суммированы в таблице.
Все сорбенты с высокой эффективностью связывают IgE. Несколько проигрывает по сравнению с сорбентами (II) и (III) сорбент (I). Полученные сорбенты обладают групповой специфичностью, но при наличии свзывания IgG взаимодействия с IgA и IgM в пределах погрешности эксперимента обнаружено не было. Концентрация IgG в исследуемой плазме крови человека обычно на 4 порядка выше концентрации IgE и, кроме того, некоторая неспецифическая сорбция IgG на сорбенте с анти^Е-лигандом ожидаема ввиду структурных сходств данных белков. Хотя количество IgG, связанных с сорбентом, и превышает количество IgE по абсолютной величине, доля удаляемых из плазмы крови IgG не превышает 2.9% при одновременном удалении порядка 50% IgE.
При проведении трех циклов хроматографии с промежуточной регенерацией не было обнаружено изменения сорбционных характеристик носи-
телей в пределах погрешности эксперимента. Эти результаты означают, что иммобилизованный ли-ганд-аптамер вероятно устойчив к действию ДНКаз плазмы крови. Все сорбенты стабильны и пригодны для многократного использования. Инвертированный нуклеотид производного аптамера (1) не дает преимуществ в стабильности, кроме того, как видно из экспериментальных данных, использование его в качестве лиганда приводит к пониженной сорбционной емкости. Для определения констант десорбции были проведены эксперименты по связыванию очищенного IgE из раствора при отсутствии других белков плазмы. Изотермы сорбции на рисунке хорошо соответствуют уравнению Ленгмюра. Рассчитанные из экспериментальных данных константы десорбции составили соответственно 0.16 ± 0.02, 0.11 ± 0.02 и 0.17 ± 0.02 нМ. Полученные для сорбентов (I), (II) и (III) значения констант согласуются по порядку величины с литературными данными по связыванию аналогичных аптамеров с IgE [11]. Как видим, несколько более прочное связывание IgE (наи-
Связанный IgE, мкг на мл геля
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
[^Б], мкг/мл
Изотермы сорбции ^Б на аффинных сорбентах с использованием ДНК-аптамеров 1 (о), 2 (□) или 3 (А) в качестве лигандов.
168
СПИРИДОНОВА и др.
меньшую константу десорбции) с аффинным носителем демонстрирует производное аптаме-ра (2) (GGG-GCA-CGT-TTA-TCC-GTC-CCT-AGT-GGC-GTG-CCC-C-(C6H12)-NH-) с экспонированным в раствор 5'-концом и алифатической аминогруппой на 3'-конце, которая присоединена ковалентно к матрице сорбента. Максимальные сорбционные емкости по связыванию 1§Б близки для всех трех сорбентов и составляют 6.8 ± 0.6, 6.9 ± ± 0.7 и 7.2 ± 0.7 мкг на 1 мл геля для аптамеров (1), (2) и (3) соответственно. Сравнительно низкая емкость сорбента с инвертированным нуклеотидом в эксперименте с плазмой крови возможно связана с неспецифическим конкурирующим связыванием каких-либо компонентов плазмы, которые отсутствуют в эксперименте с препаратом очищенного 1§Б. Таким образом, на примере аффинного сорбента, связывающего 1§Б, показана возможность получения эффективных и стабильных сорбентов на основе ДНК-аптамеров, которые могут быть использованы для медицинских и биотехнологических целей.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использованы следующие реактивы и материалы: Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, Швеция); SDS, Трис, глицин, BrCN, DMSO (Sig-ma-Aldrich, США), Coomassie G250 (Ferak, Германия); фосфорная кислота фирмы (MP Biomedicals, США); NaOH, KOH (Ämeresco, США); соляная кислота (Germed, Германия); диоксан, лимонная кислота, CuSO4, NaCl, KH2PO4, Na2CO3, H3BO3 (Реахим, Россия) марок осч; человеческий IgG фирмы Sandoz (Германия). В работе использована бидистиллированная вода. Аптаме-ры были синтезированы научно-производственной компанией "Синтол" (Россия) с использованием твердофазного амидофосфитного метода на приборе ASM-2000 (ЗАО "Биоссет", Россия). Производное аптамера (2) с алифатической аминогруппой на 5'-конце получали, присоединением амидофосфита 6-аминогексанола к 5'-конце-вому остатку гуанозина. Производное аптамера с аминогруппой на З'-конце получали, используя коммерческий полимер с закрепленным по аминогруппе аминогексанолом, содержащим диме-токситретильую защиту по гидроксилу. После снятия защиты вводили З'-концевой нуклеозид в виде амидофосфита по стандартной методике. Олигонуклеотид (1) с З'-инвертированным T (iT) получали присоединением к З'-гидроксильной группе тимидина, присоединенного к полимеру через 5'-гидроксил дезоксирибозного кольца ци-тидина. Очищенный препарат IgE получали с использованием аффинной хроматографии на колонке (общего объема 29.5 мл и сечением 4.9 см2), заполненной сорбентом на основе Sepharose 4 Fast Flow с иммобилизованными моноклональными
антителами к IgE человека, специально синтезированной для этих целей по ранее разработанной методике [9]. Через колонку пропускали 1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.