УДК 577.112.856.088.3:543.544-414.6:612.1
АФФИННЫЙ СОРБЕНТ НА ОСНОВЕ ТРИПТОФИЛТРЕОНИЛТИРОЗИНА ДЛЯ СВЯЗЫВАНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КЛАССА G: СОРБЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И АСПЕКТЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ
© 2012 г. П. А. Левашов#, Е. Д. Овчинникова, М. И. Афанасьева, Д. А. Фрид, А. А. Азьмуко, Ж. Д. Беспалова, И. Ю. Адамова, О. И. Афанасьева, С. Н. Покровский
Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, 121552, Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15А Поступила в редакцию 27.06.2011 г. Принята к печати 20.07.2011 г.
Получен хроматографический материал на основе триптофилтреонилтирозина, эффективно связывающий иммуноглобулины О человека, барана, козла и быка. Показана высокая селективность сорбента при извлечении иммуноглобулинов из плазмы крови. Эффективная сорбционная емкость составляет 15—25 мг иммуноглобулина О на 1 мл матрицы. Оптимизация метода ковалентного присоединения триптофилтреонилтирозина к полисахаридной матрице позволила достичь высокой стабильности сорбентов в условиях использования и хранения. Данный сорбент может найти применение в медицине и биотехнологии.
Ключевые слова: аффинный сорбент, трипептид, триптофилтреонилтирозин как лиганд, иммуноглобулины, аффинная хроматография.
ВВЕДЕНИЕ
Создание аффинных сорбентов, связывающих иммуноглобулины G (IgG), является весьма актуальной задачей для современной биотехнологии и медицины. В биотехнологии подобные материалы используются для выделения и очистки различных антител [1], в медицине применяются для извлечения иммуноглобулинов из плазмы крови пациентов в процедурах терапевтического афере-за, применяемого при лечении тяжелых аутоиммунных заболеваний [2, 3].
В настоящее время для связывания иммуноглобулинов наиболее часто используют аффинные сорбенты, содержащие в качестве лиганда полик-лональные антитела к иммуноглобулинам G человека [4], белок А из Staphylococcus aureus [5] или белок G из Streptococcus [6]. Данные сорбенты обладают высокой специфичностью и эффективностью удаления IgG. Однако серьезными недостатками этих сорбентов является высокая стоимость и ограниченная стабильность при хранении и эксплуатации, обусловленная использованием бел-ков-лигандов животного или бактериального происхождения. За последние годы предпринято много попыток создания высокоэффективного, высокоселективного и одновременно несложно-
# Автор для связи (+7 (495) 939-34-29; факс: +7 (495) 939-54-17; эл. почта: levashov@yahoo.com).
го в изготовлении аффинного сорбента для связывания иммуноглобулинов на основе низкомолекулярных синтетических лигандов [7—13], однако эта проблема остается по-прежнему актуальной.
В предыдущих наших сообщениях [14, 15] мы показали, что весьма хорошими сорбционными характеристиками обладает лиганд, содержащий пептидную последовательность TrpThrTyr (WTY), которая является фрагментом структуры белка G из Streptococcus [16]. Предварительно было показано, что сорбент на основе WTY эффективен в связывании основной разновидности иммуноглобулинов G всех подклассов (G1, G2, G3, G4), а также способен связывать иммуноглобулины M, A и E [15]. Было установлено, что при выборе гемосовместимой матрицы, сорбент с данным лигандом биосовместим с цельной кровью и, соответственно, может быть пригоден для медицинских процедур гемосорбции [14]. Также была предложена оригинальная несложная методика иммобилизации лиганда, подходящая для получения сорбента с превосходными операционными характеристиками, пригодного для стерилизации методом автоклавирования [17]. Данная статья посвящена описанию характеристик нового сорбента, полученного с использованием предложенных нами нового WTY-лиганда и нового метода его ковалентой иммобилизации на матрицу.
ПОЛИМЕРНАЯ / МАТРИЦА
НО,
О
НО^СН,
О
св
я
св М
Ч О
ю
20 -
15 -
О 10 зд
нн
=к
Я 5 Я
се
т «
<ч
С
1.1 ! 1
Рис. 1. Схема строения сорбента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для синтеза сорбента с новым лигандом нами была адаптирована наша оригинальная методика [14, 17], включающая связывание содержащего аминогруппу лиганда на аминированной матрице с помощью глутарового альдегида с последующим восстановлением основания Шиффа обработкой №ВН4. Лиганд в получаемом сорбенте связан с полисахаридной матрицей прочными стабильными химическими связями С—С и С—^ Молекулярный мостик оптимизирован с учетом целей упрощения синтеза сорбента и отсутствия стерических затруднений при связывании белка. На рис. 1 показано схематически химическое строение сорбента на основе матрицы $ерИаго8е.
Важным показателем широких возможностей применения WTY-сорбента на практике, является его способность связывать иммуноглобулины различного животного происхождения. В эксперименте "сорбции в объеме" с препаратами очищенных иммуноглобулинов О (3 мг/мл) мы сравнивали WTY-сорбент с коммерческим сорбентом, несущим антитела барана против 1§О человека (Адсопак). Полученные величины сорб-ционной емкости WTY-сорбента составили для ^О человека 11.2 ± 0.9, ^О быка - 11.0 ± 1.1, ^О барана — 13.4 ± 1.3 и 1§О козла — 14.3 ± 1.9 мг белка на мл геля. Таким образом, WTY-сорбент проявляет способность эффективно связывать 1§О различных животных. Для Адсопак аналогичные величины составили 14.1 ± 0.3, 1.5 ± 0.4, 0.3 ± 0.2 и 0.3 ± 0.2 мг белка на мл геля.
Как видим, Адсопак, несмотря на свои превосходные характеристики [4], специфичен только к человеческим иммуноглобулинам, что сужает его область применимости в биотехнологии. Этот факт объясняется тем, что основу Адсопака составляют поликлональные антитела барана против 1§О человека, распознающие антигенные эпитопы, которые характерны для 1§О человека. При этом у барана не вырабатывается антител,
2 4 6 8
Свободный в растворе, мг/мл
10
Рис. 2. Изотермы адсорбции иммуноглобулина О человека на 8ерИаго8е-ТгрТИгТуг (1), Адсопаке (2).
распознающих эпитопы одинаковые для человека и барана.
Хорошее связывание 1§О разных животных для WTY-сорбента, содержащего фрагмент пептидной последовательности стрептококкового белка О может быть связано с наличием в константой части иммуноглобулинов высоко консервативного участка, специфически связывающегося с определенной областью бактериального белка. Эволюционно это можно объяснить особо высокой патогенностью ряда бактерий для данных животных, приведшей к развитию альтернативной способности иммуноглобулинов к связыванию с бактериальным белком вне зависимости от специфичности вариабельной части 1§О.
Из литературы известно, что именно Fc-фраг-мент иммуноглобулинов отвечает за связывание с бактериальным белком О [18]. В связывании иммуноглобулинов участвует В1-домен белка [18], который содержит в области связывания фрагмент структуры WTY, однако достаточность присутствия данной трипептидной последовательности для связывания иммуноглобулинов до сих пор в литературе не рассматривалась. Как известно, сорбенты на основе полных белков А и О также неодинаково применимы для связывания иммуноглобулинов разных животных [19, 20]. Таким образом, новый сорбент может оказаться весьма перспективным для широкого спектра задач биотехнологии.
Для точного планирования хода хроматогра-фического разделения важно знать детальные характеристики связывания белков с сорбентами. Ключевыми характеристиками являются константа десорбции белка для заданных условий хроматографии и максимальная емкость сорбента для данного белка. На рис. 2 представлены изотермы сорбции иммуноглобулина О человека на
5 -
О
ад
4 -
м о ч о И
3 -
10 8
6 Я
л
2 -
1 -
20
25 30 35 40 Номер фракции
45
50
Рис. 3. Хроматограмма одностадийного выделения человека на аффинной колонке с сорбентом ЗерИагсве-ТгрТЪгТуг. Контроль элюата: ^280 (1), рН (2), белок по микробиуретовому методу [24, 25] (3), содержание (4).
М, кДа
31 32 Фракции
41
42
Рис. 4. Электрофореграмма хроматографических фракций (рис. 3).
0
WYT-сорбенте в сравнении с коммерческим сорбентом Адсопак на основе иммобилизованных антител к человеческим 1§0. Полученные изотермы сорбции хорошо описываются уравнением Ленгмюра вида S = (£мах[1ё0]/(К + [^Ш, где S — количество связанного с матрицей 1§0, ^тах — максимальная сорбционная емкость, [1§С] — концентрация свободного иммуноглобулина в растворе. Из экспериментальных данных, соответственно, получаем для коммерческого сорбента с антителами ^ = 7.8 ± 0.5 х 10-7 М и ^тах = = 15.7 ± 1.6 мг на 1 мл геля, для нового сорбента с WYT-лигандом К = 1.8 ± 0.3 х 10-5 М и £тах = = 27.4 ± 2.9 мг на 1 мл геля.
Как видим, константа десорбции иммуноглобулинов для нового сорбента больше в 23 раза, чем таковая для сорбента на основе иммобилизованных антител. Высокое значение константы десорбции при соизмеримых значениях максимальной сорбционной емкости могло бы стать серьезным недостатком WYT-сорбента по сравнению с Адсопак, однако высокое значение емкости WYT-сорбента компенсирует эту возможную проблему, делая новый сорбент даже более эффективным при концентрациях 1§0, характерных для плазмы крови (8—17 мг/мл в норме для человека [21]). Кроме того, высокое значение константы десорбции может быть весьма полезным на практике, так как при необходимости можно подбирать "более мягкие" условия элюции иммуноглобулинов, в большей степени сохраняя на-тивность 1§С. Тем не менее, следует принимать во внимание, что сравнительно большое значение константы десорбции могут приводить к повышенной утечке иммуноглобулинов при промывке сорбента до подачи элюента. Эту особенность но-
вого сорбента легко учесть при планировании хроматографической очистки, исключив избыточные промывки сорбента после связывания иммуноглобулинов.
Как уже было предварительно показано ранее, для элюции иммуноглобулинов и регенерации сорбента могут быть использованы буферные смеси с рН ниже 3 [14, 15]. Как видно из рис. 3, иммуноглобулины элюируются компактным пиком в градиенте рН начиная со значений 4 и ниже. Представленные на рис. 4 данные электрофореза показывают, что в данных условиях проведения хроматографии получен практически гомогенный
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.