УДК 577.113.7
АФФИННЫЙ ЗАХВАТ ЗАДАННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК С ПОМОЩЬЮ КОРОТКИХ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
© 2013 г. В. С. Михайлов*, В. К. Потапов*, Р. Н. Амирханов**, ***, Н. В. Амирханов**, ***, С. С. Буланенкова*, С. Б. Акопов*, В. Ф. Зарытова**, ***,
Л. Г. Николаев**, Е. Д. Свердлов*
*Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 117997,
Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая,16/10 **Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8 ***Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск Поступила в редакцию 26.06.2012 г. Принята к печати 06.07.2012 г.
Сравнивали способность коротких олигомеров пептидо-нуклеиновой кислоты и олигонуклеоти-дов, содержащих модифицированные остатки 5-метилцитидина, 2-аминоаденозина и 5-пропинил-2'-дезоксиуридина ($ВО), обладающих повышенным сродством к комплементарной нуклеотидной последовательности, производить аффинный захват целевого двунитевого фрагмента ДНК с такой последовательностью одной из цепей из смеси фрагментов по механизму концевой инвазии. Оба типа зондов в подобранных условиях показали высокую эффективность отбора. Зонды на основе $ВО могут представлять собой более доступную и простую в приготовлении альтернативу ПНК для этих целей.
Ключевые слова: ДНК, аффинный захват, пептидо-нуклеиновая кислота, strong binding oligonucleotide (SBO).
DOI : 10.7868/S0132342313010077
ВВЕДЕНИЕ
Прямой отбор фрагментов ДНК с заданной последовательностью из их гетерогенной смеси нашел широкое применение в молекулярной биологии, геномике и ДНК-диагностике. В отличие от методов, основанных на ПЦР, прямой отбор обладает важными преимуществами, в частности, он позволяет отбирать фрагменты ДНК большой длины и с сохранением содержащихся в них эпигенетических маркеров, таких как метилированные основания ДНК [1]. При помощи различных вариантов этого подхода можно клонировать геномные последовательности [2], определять присутствие возбудителей инфекции в клинических образцах [3], наличие определенных видов организмов в окружающей среде [4] и т.д. (см. [1]).
Сокращения: ПНК — пептидо-нуклеиновая кислота (peptide nucleic acid); AEEA — аминоэтоксиэтоксиацетил; Fmoc — 9-флуоренилметоксикарбонил; SBO — олигонуклеотид с повышенным сродством к комплементарной последовательности (strong binding oligonucleotide); TFA — трифтор-уксусная кислота; DMF — диметилформамид.
# Автор для связи (тел.: +7(495)330-70-29; факс: +7(495)330-65-38; эл. почта: lev@ibch.ru).
Прямой отбор основан на комплементарном взаимодействии искомого фрагмента НК с относительно коротким зондом, в качестве которого может выступать клонированный однонитевой фрагмент НК или синтетический олигонуклеотид. Для эффективного отбора двунитевых фрагментов ДНК, когда вытеснение комплементарной цепи зондами на основе обычной ДНК энергетически невыгодно, используются зонды с повышенным сродством к комплементарной последовательности, такие как синтетические пеп-тидо-нуклеиновые кислоты (ПНК) [5, 6], замкнутые нуклеиновые кислоты (locked nucleic acids, LNA) [7, 8], а также модифицированные различным образом олигонуклеотиды (strong binding oli-gonucleotides, SBO) [9, 10].
Возможны три типа взаимодействий зонда с целевым фрагментом двунитевой ДНК:
1. Концевая инвазия — зонд за счет более высокого сродства к комплементарной последовательности одной из цепей ДНК-фрагмента расплетает его концевую область [11].
2. Формирование зондом тройной спирали с последовательностью целевого ДНК-фрагмента [12]. Недостаток этого типа взаимодействия состо-
ит в том, что для образования такой структуры целевой фрагмент ДНК должен содержать гомопури-новую последовательность существенной длины. Кроме того, стабильность тройной спирали обычно невысока [13].
3. Взаимодействие зонда с однонитевым участком ДНК, образующимся за счет связывания комплементарного участка целевого фрагмента вспомогательным олигонуклеотидом или ПНК (метод oligonucleotide/PNA affinity capture, OPAC), см. [1]).
В настоящей работе мы сравнили эффективность аффинного захвата фрагмента ДНК при концевой инвазии с помощью ПНК и модифицированных олигонуклеотидов с повышенным сродством к комплементарной цепи (SBO).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее было показано, что относительно короткие фрагменты ПНК (20 и менее звеньев), содержащие природную последовательность оснований, способны к концевой инвазии в двунитевую линейную ДНК, обладающую комплементарной ПНК концевой последовательностью одной из цепей, причем образующиеся комплексы достаточно прочны и специфичны для того, чтобы происходил аффинный захват целевого фрагмента из смеси [11]. Мы предположили, что подобным свойством могут обладать и олигонуклеотиды, содержащие модифицированные остатки 5-пропи-нилдезоксиуридина, 5-метилцитидина и 2-амино-аденозина, отличающиеся повышенным сродством к комплементарным последовательностям [14, 15]. Подобные модифицированные SBO-оли-гонуклеотиды, как было показано нами ранее, способны служить эффективными праймерами для ПЦР и секвенирования [16].
Для определения эффективности аффинного захвата фрагмента ДНК при помощи зондов двух разных типов мы приготовили эквимолярную модельную смесь двух фрагментов генома человека — целевого фрагмента промотора гена ZBTB32 длиной 61 п.о. и контрольного фрагмента ДНК из межгенной области хромосомы 10 длиной 84 п.о. Температуры плавления фрагментов в условиях связывания с зондами были определены экспериментально при помощи амплификатора Mx3000P (Stratagene) и составили 78.7 и 88.7оС соответственно для целевого и контрольного фрагментов.
Для отбора целевого фрагмента из смеси были приготовлены биотинилированные по N-концу ПНК-зонды длиной 16 звеньев (ПНК1 и ПНК2) и биотинилированные по 5'-концу модифицированные олигонуклеотидные зонды длиной 20 нт (SBO1 и SBO2) (структуру см. в экспер. части). Для придания большей растворимости в воде синтезированные ПНК содержали на N- и С-кон-
цах цепи по две аминоэтоксиэтоксиацетильные (АЕЕА) линкерные группы.
Полученные ПНК-зонды образуют достаточно прочные гибридные ПНК/ДНК-дуплексы с соответствующими синтезированными нами 20-звен-ными комплементарными дезоксиолигонуклеоти-дами с Тпл 70 и 74°С соответственно для ПНК1 и ПНК2, что подтверждает последовательность и структуру синтезированных ПНК-олигомеров.
Каждый из зондов обеих пар был комплементарен одному из концов целевого фрагмента ДНК. Отбор (см. схему эксперимента на рис. 1) проводили при концентрации каждого из фрагментов ~10-5 мкМ и ~10000-кратном избытке зонда в низкосолевом буфере для ПНК или в 500 мМ №С1 для 8ВО. Отжиг фрагмента с зондом осуществляли при температуре 50°С, т.е. существенно ниже температуры плавления фрагментов ДНК при тех же условиях. Отметим, что добавление при отжиге ~40 нг/мкл фрагментированной ДНК из молок лосося практически не влияло на эффективность отбора фрагментов (данные не показаны), хотя в этом случае примененный нами метод анализа не позволяет исключить присутствие в конечном образце и некоторого количества ДНК лосося.
Далее связавшиеся с зондом фрагменты отбирали при помощи магнитных частиц, несущих стреп-тавидин ^упаЪеаё8), и отделяли от частиц при температуре, превышающей температуру плавления олигонуклеотида или ПНК.
Соотношение количеств целевого и контрольного фрагментов в конечной смеси определяли при помощи количественной ПЦР в реальном времени. Результаты отбора представлены на рис. 2.
Из рисунка видно, что при использовании зондов обоих типов происходит значительное (два-три порядка величины) обогащение конечной смеси целевым фрагментом ДНК, при этом 8ВО-зонды по степени обогащения мало уступают зондам на основе ПНК. В то же время, в условиях связывания с зондами на основе 8ВО наблюдается значительный фон (связывание фрагмента с носителем в отсутствие зонда), что понижает эффективность отбора. Этот эффект скорее всего обусловлен различной степенью неспецифического связывания с магнитными частицами целевого и контрольного фрагментов ДНК при высокой концентрации соли, используемой при отборе с 8ВО. В пользу этого предположения говорит тот факт, что при отборе с ПНК, где применяется низкая концентрация соли, аналогичный фон значительно ниже (рис. 2).
Таким образом, из полученных данных можно сделать следующие выводы:
Смесь двунитиевых фрагментов ДНК
1 Контрольный фрагмент
Зонд X") Биотин
Целевой фрагмент +
Концевая инвазия
_^^ ^О
2
Снятие с носителя
Рис. 1. Схема отбора целевого фрагмента из смеси фрагментов при помощи зондов, действующих за счет концевой инвазии.
1. Короткие зонды на основе ПНК и 8ВО способны с достаточно высокой эффективностью аффинно захватывать целевой фрагмент из смеси фрагментов ДНК. При этом эффективность отбора с ПНК-зондами остается несколько выше, чем с 8ВО-зондами.
2. Тем не менее, зонды на основе 8ВО, как более доступные и простые в приготовлении, могут представлять собой альтернативу ПНК для отбора целевых фрагментов ДНК из смесей.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве ДНК использовали: целевой фрагмент промотора гена ZBTB32, 61 п.о. (ДНК1) и контрольный фрагмент хромосомы 10 человека, 84 п.о. (ДНК2).
Получение зондов SBO
Фосфорамидиты 5-метилцитидина и 2-амино-аденозина получали согласно [15]. Фосфорамидиты 5-пропинил-2'-дезоксиуридина — коммерческие продукты фирмы Glen Research (USA). Для последующего присоединения биотина на 5'-конец олигонуклеотидов вводили аминолинкер, представляющий собой 6-аминогексанол, содержащий фосфорамидит по спиртовой группе и Fmoc-защиту по аминогруппе (Glen Research), удаляемую при деблокировании. Синтез модифицированных олигонуклеотидов проводили на синтезаторе ASM-800 (Biosset, Новосибирск). По завершении синтеза олигонуклеотиды отщепляли от носителя и деблокировали по стандартной методике обработкой смесью аммиак—метиламин при 50оС в течение 60 мин с последующим высаживанием в 2% растворе перхлората натрия в ацетоне. Продукт очищали методом офВЭЖХ. Были синте-
m 10000
га
р
о
и
я
о
я
св
о
VO
о о о я
л ч
в
и
о о
£ о
10
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.