УДК 577.352.465
АГОНИСТ-СПЕЦИФИЧНОЕ УЧАСТИЕ SOC- И ARC-КАНАЛОВ И iPLA2 В РЕГУЛЯЦИИ ВХОДА Са2+ ПРИ КОЛЕБАТЕЛЬНЫХ ОТВЕТАХ
В АДИПОЦИТАХ
© 2013 г. Е. А. Туровский, Н. П. Каймачников*, В. П. Зинченко
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3;
*электронная почта: nkai@mail.ru Поступила в редакцию 01.06.2013 г.
Активация входа Са2+ при стимуляции клеток агонистами может обеспечиваться различными механизмами, включая депо-управляемый вход Ca2+ (store-operated calcium entry, SOCE) и действие продуктов фосфолипазы A2 (PLA2). В связи с существованием в адипоцитах двух относительно независимых путей мобилизации С?г+ из внутриклеточных запасов, в данной работе мы изучили, сопряжены ли эти пути с индивидуальными механизмами входа Са2+ в клетку. Показано, что ацетилхолин (ACh) вызывает колебательные изменения концентрации Са2+ в цитозоле, не зависящие от ингиби-рования SOCE посредством YM-58483 или 2-APB. Эти колебания устранялись при добавлении La3+, который ингибирует как депо-управляемые Ca2+-каналы, так и ARC-каналы (регулируемые арахидоновой кислотой, АА). Ответы на ACh подавлялись AACOCF3, ингибирующим PLA2 типов IV и VIA (iPLA2). Колебания под действием эмбриональной коровьей сыворотки (FBS), отличавшиеся достижением базального уровня между спайками, напротив, прекращались в присутствии YM-58483 или La3+, но не зависели от AACOCF3. Одна и та же клетка могла отвечать на ACh и FBS при их последовательном добавлении в любом порядке с промежуточной отмывкой. Подобные по форме колебательные ответы (от базального или повышенного уровня) на фенилэфрин постепенно затухали после ингибирования фосфолипазы C или рецептора инозитол-1,4,5-трисфосфата и частично ослаблялись ингибиторами YM-58483 или La3+ без существенного влияния AACOCF3. АА в концентрации 1—10 мкМ вызывала колебания при добавлении как после спонтанного прекращения ACh-индуцированных колебаний, так и самостоятельно, причем после ACh отчетливый эффект достигался при меньших концентрациях АА. Ингибитор кальмодулина R24571 вызывал колебания, которые могли подавляться YM-58483 или AACOCF3, что указывает на активацию, соответственно, SOCE и iPLA2. В целом эти результаты показывают, что механизм активации входа Са2+ зависит от того, какой сигнальный путь затрагивается агонистом. Ацетилхолин не вовлекает SOCE, но активирует PLA2 с вероятным участием формы VIA, что сопровождается действием ее продукта(-ов) на ARC-каналы и, возможно, на лизофосфолипид-активируемые каналы. FBS действует через SOCE без участия PLA2. Эти два варианта могут сосуществовать в случае фенилэфрина.
Ключевые слова: кальциевые колебания, адипоциты, Са2+-каналы, вход Са2+, фосфолипаза А2.
Б01: 10.7868/80233475513050204
Вход Са2+ в клетку при агонист-индуцируемых сигналах играет важную модулирующую роль в колебаниях, отражающих периодическое высвобождение Са2+ из внутриклеточных запасов [1, 2]. Ранее мы показали наличие в адипоцитах двух путей генерации колебательных Са2+-ответов, которые включают мобилизацию запасенного Са2+ через рецептор инозитол-1,4,5-трисфосфата
Сокращения: АА — арахидоновая кислота, PLA2 — фосфолипаза A2, FBS — эмбриональная коровья сыворотка, ACh — ацетилхолин, SOCE — депо-управляемый вход Ca2+, IP3R — рецептор инозитол-1,4,5-трисфосфата, PLC — фосфолипаза C, RyR — рианодиновый рецептор, PI3K — фосфатиди-линозитол-3-киназа, ЭР — эндоплазматический ретику-лум, XeC — ксестоспонгин С, CaM — кальмодулин.
(IP3R) при участии фосфолипазы C (PLC) или мобилизацию через рианодиновый рецептор (RyR) при участии фосфатидилинозитол-3-кина-зы (PI3K) с образованием NO. Колебания, вызываемые активацией этих путей, различаются по форме и продолжительности. В обоих случаях для поддержания колебаний требуется вход Ca2+ через плазматическую мембрану [3]. В настоящее время идентифицировано несколько механизмов регуляции входа Ca2+. Во многих клетках показан депо-управляемый вход Ca2+ (store-operated calcium entry, SOCE), который является результатом снижения концентрации Ca2+ в эндоплазматиче-ском ретикулуме (ЭР). SOC-каналы представле-
S 2
К н О
2, a-
£ 1
0
TG 10 мкМ EGTA 0.5 мМ
- Ca2+ 1.3 мМ
YM-58423
- l
2
1 \5SN3
1
..... 3 i
0 200 400 600 800 1000 1200 Время, с
Рис. 1. Ответы цитозольного Са2+ в адипоцитах на аппликацию 10 мкМ тапсигаргина (TG) в бескальциевой среде с последующей заменой на среду с 1.3 мМ Са2+ без (1) и с добавлением 1 мкМ (2) или 10 мкМ (3) УМ-58483. п = 19 (1), 25 (2) и 27 (3). Данные по флуоресценции Рига-2 усреднены для указанного числа клеток и нормированы на амплитуду ответа на TG.
ны прежде всего селективными к Са2+-каналами, которые проводят ток, получивший название CRAC, образованы субъединицами Orail и активируются взаимодействием с Са2+-сенсором STIM1, локализованным в ЭР. Существуют также неселективные SOC-каналы, возможно, образуемые белками семейства TRPC в комплексе с Orail [4]. Вход Са2+ может регулироваться продуктами фосфолипазы iPLA2 (изоформа VIA или iPLA2P) [5, 6]. Эта изоформа непосредственно от Ca2+ не зависит и ингибируется комплексом Са2+ с каль-модулином (CaM). Предполагается, что ее физиологическим активатором является еще не идентифицированный фактор входа Са2+, который смещает СаМ с iPLA2 [5]. Имеются данные в пользу того, что при низких уровнях стимуляции, приводящих к колебаниям Са2+, основную роль играют селективные ARC-каналы, активируемые арахидоновой кислотой (АА) и не зависящие от истощения внутриклеточных кальциевых запасов. Активация каналов осуществляется самой АА, поскольку активация сохраняется после ин-гибирования ферментов метаболизма АА [7]. По данным in vitro, источником АА при такой стимуляции агонистом является цитозольная сPLA2 (изоформа IV) [8]. С другой стороны, некоторые факты свидетельствуют о возможности поддержания колебаний в клетках HEK293 за счет SOCE [2].
В данной работе исследовано участие SOC- и ARC-каналов, а также iPLA2 в генерации колебательных Ca^-ответов в адипоцитах при стимуля-
ции рецепторов, сопряженных преимущественно с сигнальными путями PLC — IP3R и PI3K — RyR. Была поставлена задача установить, различаются ли механизмы входа Ca2+ в этих двух случаях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клетки-предшественники белого жира (пре-адипоциты) эпидидимального депо выделяли из мышей линии NMRI (3—5 недель) и культивировали в соответствии с ранее описанным протоколом [3, 9]. В эксперименте использовали культуру на 8—9-й день культивирования. Регистрацию уровня цитозольного кальция в клетках, нагруженных флуоресцентным кальциевым зондом Fura-2, проводили с помощью системы анализа изображений "Cell observer" (Carl Zeiss, Германия) на базе моторизованного микроскопа Axio-vert 200M. Клетки находились в среде Хенкса, содержащей 20 мМ HEPES и 200 мкМ Х-аргинина. Флуоресценция Fura-2 возбуждалась при 340 и 387 нМ. При регистрации сигнала с добавлением эмбриональной коровьей сыворотки (FBS) в результат вносилась поправка, учитывающая собственную флуоресценцию FBS. Для подачи веществ использовали систему, позволяющую производить аппликацию к клеточной культуре адипоцитов различных активаторов и ингибиторов, а также осуществлять полную смену среды в экспериментальной ячейке. В эксперименте получали серии изображений культуры с интервалом 3 с. Для обработки серий изображений использовали программу ImageJ 1.44. В подписях к рисункам приведено число клеток (n) с представленным типом Ca^-ответа.
В работе использовали: среду DMEM (Sigma, США), эмбриональную коровью сыворотку (Gib-co, США), гентамицин (Дальхимфарм, Россия), HEPES, сбалансированный солевой раствор Хенкса (Calbiochem, США), Fura-2AM (Fluka, Швейцария), коллагеназу (тип II), AACOCF3, тапсигаргин, арахидоновую кислоту, ксестоспон-гин С, U73122, R24571, 2-APB (Sigma, США), YM-58483 (Tocris, Bioscience, Великобритания).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для проверки наличия в адипоцитах SOCE производилось ингибирование Са2+-АТР-азы ЭР тапсигаргином (TG) в бескальциевой среде, приводившее к истощению кальциевых запасов. После повышения Ca2+ внеклеточной среды до нормального уровня наблюдался увеличенный вход Са2+ через каналы плазматической мембраны (рис. 1), т.е. механизм SOCE в адипоцитах присутствует. Этот вход дозозависимо уменьшался YM-58483, ингиби-рующим [10] CRAC-каналы. При 1 мкМ YM-58483 начальная скорость входа снижалась до 12% относительно контроля, и при 10 мкМ происходило полное подавление (см. рис. 1). Ниже анализиру-
3
0.6 г
1 1
0 200 400
г
ББВ
0 200 400 600 0 200 400
д е
УМ-58483
0.55 -
0.50 0.45 0.40
200 400 600 0 300 600 900
300
600
200 400 Время, с
300 600 Время, с
300 600 Время, с
„2+
в отдельных адипоцитах культуры на добавление 5 мкМ ацетилхолина (верхний
Рис. 2. Ответы цитозольного Са
ряд), 1% эмбриональной коровьей сыворотки (ББВ) (среднийряд) и 10 мкМ фенилэфрина (нижний ряд). В ходе Са2+-ответа добавляли 1 мкМ УМ-58483 (левый столбец), 1 мМ Ьа (средний столбец) и 15 мкМ ЛЛСОСр3 (правый столбец). В каждом случае представлен преобладающий тип ответов, п = 28 (а), 21 (б), 18 (в), 37 (г), 25 (д), 14 (е), 34 (ж), 29 (з), 23 (и).
ется вклад 8ОСЕ и других механизмов при колебаниях различного происхождения.
Ранее было установлено, что ацетилхолин (ЛСИ) индуцирует в адипоцитах колебания внутриклеточного Са2+, которые обусловлены участием ЯуЯ без существенного вклада 1Р3Я и характеризуются постепенным дрейфом с уменьшением частоты и прекращением колебаний у большинства клеток через 5 мин [3]. Рис. 2а показывает, что УМ-58483 не подавляет такие колебания (для иллюстрации на этой панели выбрана клетка с длительными колебаниями). Кроме того, преин-кубация клеток в течение 11.5 мин с этим ингибитором не предотвращала колебательные ответы. Были проведены также эксперименты с ингибиторами, которые действуют на 8ОС-каналы и те-
стировались в отношении ЛЯС-каналов. К ним относятся Ьа3+, ингибирующий ЛЯС-каналы [7], и 2-ЛРБ, действующий на ряд каналов семейства ТЯР, включая ТЯРС1, без влияния [7] на ЛЯС-ка-налы. Добавление Ьа3+ быстро уменьшало амплитуду и/или частоту колебаний, причем последующая о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.