УДК 576.314.6.088.6+612.11,612.82.015
АГОНИСТЫ И АНТАГОНИСТЫ р-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ -МОДУЛЯТОРЫ АКТИВНОСТИ а2-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ МЕМБРАН
КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС © 2011 г. Л. А. Нестерова, Б. Н. Манухин
Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 26; факс 8 (499)135 8012; электронная почта: manukhinb@mail.ru
Поступила в редакцию 16.03.2010 г.
На субклеточных фракциях мембран коры головного мозга крыс изучено влияние активации и блокады в-адренорецепторов изопропилнорадреналином и пропранололом на связывание специфического неселективного антагониста а2-адренорецепторов [3Н]КХ821002. Установлено, что лиганд-рецепторное взаимодействие а2-адренорецепторов соответствует модели: один по аффинности пул рецепторов и присоединение двух молекул лиганда к одному димерному рецептору. Параметры связывания [3Н]КХ821002 - Кй = 1.57 ± 0.27 нМ, Бтах = 7.24 ± 1.63 фмоль/мг белка, п = 2. При активации в-адренорецепторов изопропилнорадреналином связывание радиоактивного лиганда с а2-ад-ренорецепторами происходит по такой же модели. Чувствительность а2-адренорецепторов к [3Н]КХ821002 снижается на 56% (К = 3.55 ± 0.02 нМ), а количество активных адренорецепторов увеличивается на 69% (Бтах = 12.24 ± 0.06 фмоль/мг белка). Под влиянием пропранолола изменяется характер связывания лиганда — определяются два пула рецепторов с параметрами Ки = 0.61 ± ± 0.02 нМ, Кй2 = 3.41 ± 0.13 нМ, Бт1 = 1.88 ± 0.03 фмоль/мг белка, Бт2 = 9.27 ± 0.08 фмоль/мг белка, п = 2. Количество активных рецепторов (Бтах) возрастает на 54%. Предполагается, что в субклеточных фракциях мембран головного мозга крыс а2-адренорецепторы существуют в виде димеров. Выявлено модулирующее действие изопропилнорадреналина и пропранолола на связывание специфического антагониста а2-адренорецепторами, которое проявляется в ингибировании и изменении общего характера связывания [3Н]КХ821002.
Ключевые слова: субклеточные фракции мембран головного мозга крыс, связывание, антагонист а2-адре-норецепторов [3Н]КХ821002, изопропилнорадреналин, пропранолол, димеры рецепторов.
Реакция организма, органа или клетки на изменение внешней или внутренней среды является результатом взаимодействия нескольких регуля-торных систем. Взаимодействия (cross-talks) могут быть как антагонистическими, так и однонаправленными и осуществляются на уровнях от организменного до клеточного. Межклеточное взаимодействие в нервных системах происходит с участием специфических рецепторов. Так, аго-нист а^-адренорецепторов метоксамин, антагонист М-холинорецепторов атропин и мембрано-тропный агент кокаин модулируют связывание [3Н]дигидроалпренолола p-адренорецепторами нативных эритроцитов крыс [1]. В мембранах мозга цыплят серотонин изменяет параметры связывания специфического антагониста [3H]RX821002 с а2-адренорецепторами [2]. Аце-тилхолин модулирует активность дыхательного ритма через никотиновые и мускариновые холи-норецепторы, взаимодействуя с а2-адренорецеп-торами [3]. Обнаружен модуляторный эффект рецепторов аденозина А1 на а2-адренорецепторы в культуре нейронов нормо- и гипертензивных
крыс [4]. Агонисты и антагонисты а2-адреноре-цепторов влияют на спинальную холинергиче-скую систему крыс [5]. Клонидин регулирует микроциркуляцию у спонтанно гипертензивных крыс [6]. а2- и р-адренорецепторы в нейронах мезэнцефального красного ядра модулируют ответы ОЛБЛЛ и ОЛБЛБ [7]. Неселективный бло-катор ах-рецепторов доксазосин ингибирует сократительную реакцию мочевого пузыря кролика на серотонин и связывание [3Н]5-гидрокситрипта-мина со специфическими рецепторами [8]. а2-Адре-норецепторная система принимает участие в модуляции супраспинальной опиоидной анальгезии [9]. Опиоидный агонист меперидин взаимодействует с а2-адренорецепторами [10]. Агонист р-адреноре-цепторов СОР-12177Л является неселективным аго-нистом агадренорецепторов [11].
Приведенные данные свидетельствуют о взаимодействии нейротрансмиттерных систем. В ра-диолигандных экспериментах оно более вероятно на уровне мембраны клетки. Можно предположить, что присоединение нейротрансмиттера к своему рецептору изменяет активность других ре-
цепторов, модулируя специфические реакции клеток.
Задачей работы было изучение действия специфических агониста и антагониста ß-адренорецепторов — изопропилнорадреналина и пропранолола — на кинетику связывания специфического неселективного антагониста а2-адренорецепторов [3H]RX821002 субклеточными фракциями мембран коры головного мозга крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проводили на субклеточных фракциях мембран коры головного мозга крыс-самцов линии Вистар (210—250 г), которые выделяли по методу Henn S.W. и Henn F.A. [12]. Готовые мембранные препараты хранили при —70°С в течение 3 нед. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [13], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (Sigma). Связывание радиоактивного лиганда проводили в инкубационной среде с последующим отмыванием мембран от несвязанного лиганда на стекловоло-конных фильтрах GFB [14]. Объем инкубационной среды составлял 100 мкл — 50 мкл суспензии мембран, трис-НС1-буфер 50 мМ, pH 7.4, "холодный" вытеснитель, агонист или антагонист ß-адренорецепторов и радиоактивный лиганд. Реакцию останавливали 1 мл холодного буфера (0°С). Для определения параметров связывания лиганда с а2-адренорецепторами использовали специфический неселективный антагонист а2-адреноре-цепторов [3H]RX821002 (Amersham, Великобритания, 77 Ки/мМ) в концентрации 0.33—6.60 нМ. Специфическое связывание радиоактивного ли-ганда определяли по разнице между общим и неспецифическим связыванием в присутствии нерадиоактивного лиганда — раувольфсцина в концентрации 10 мкМ. В качестве агониста и антагониста ß-адренорецепторов использовали изопропилнорадреналин и пропранолол (Sigma) в концентрации 10 мкМ. Смесь инкубировали в течение 30 мин при 22°С. Вещества вводили в инкубационную среду за 20 мин до добавления [3H]RX821002.
Для определения закономерностей связывания антагонистов со специфическими рецепторами использовали математические и графические методы анализа лиганд-рецепторных взаимодействий [15]. Ранее теоретически и экспериментально было показано, что взаимодействие специфических радиоактивных антагонистов адре-норецепторов с субклеточными фракциями мембран коры головного мозга крыс описывается уравнениями для одного или двух пулов рецепторов. Действие каждого из исследованных веществ анализировали с использованием 9 математических моделей связывания лиганда рецептором [16]. Установлено, что взаимодействие лиганда с
а2-адренорецепторами субклеточных фракций мембран коры головного мозга крыс в контроле соответствует модели с одним, а в эксперименте с одним или двумя пулами рецепторов и присоединением двух молекул лиганда к рецептору.
b = [CBmax4n)/( К + An)], (1)
b = [(£mAn1)/(KiJ + An1)] + [(Bm2An2)/( + An2)],(2)
где b — количество связанного лиганда, Bmax (фмоль/мг белка) — количество мест связывания лиганда с константой диссоциации Kd (нМ), Bm1 и Bm2 — количество мест связывания лиганда в высоко- и низкоаффинном пулах рецепторов в одной эффекторной системе с константами диссоциации Kd1 и Kd2 и коэффициентами Хилла n1 и n2, [A] — концентрация лиганда в среде. Расчет основных параметров лиганд-рецепторного взаимодействия - Kd, Bmax, Kd1, Kd2, Bm1, Bm2 и Пь П2 -проводили с помощью компьютерной программы "SigmaPlot". Эффективность связывания ли-гандов с рецепторами оценивали по уравнению:
E = Bmax/2Kd. (3)
Эффективность (Е, фмоль/мг белка/нМ) — интегральный показатель, количественно характеризующий величину связывания лиганда при его концентрации, равной Kd [15]. На рис. 1 и 2 приведены данные конкретных опытов, а в таблице — средние результаты экспериментов. Теоретические кривые строили по уравнениям (1) и (2). На теоретические кривые нанесены экспериментальные точки. В опытах было по 7—9 концентраций лиганда, каждая с трехкратным повтором. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (р < 0.05). Все значения представлены как средние арифметические и стандартные ошибки средней (M ± SEM) (таблица).
Для количественной оценки влияния исследованных веществ на основные параметры лиганд-рецепторного взаимодействия (Kd или Bmax) рассчитывали их концентрации активации и инги-бирования по уравнениям (4)—(6):
/С50 = (IKdc)/(Kde — Kdc), (4)
AC50 = (IBmaxc)/(Bmaxe — Bmaxc). (5)
Общий эффект веществ на связывание [3H]RX821002 определяли по уравнениям, включающим оба основных параметра (Kd и Bmax):
IC50 = IKKdcBmaxe)/(KdeBmaxc — KdcBmaxe)], (6)
где показатель IC50 (нМ) для уравнения (4) соответствует концентрации вещества, снижающей активность рецепторов (повышение Kd) в 2 раза, а AC50 (нМ) для уравнения (5) соответствует концентрации вещества, повышающей количество рецепторов (Bm) в 2 раза. Величина IC50 в уравнении (6) показывает теоретическую концентрацию
Рис. 1. Экспериментальные точки и теоретические кривые специфического связывания [3Н]КХ821002 а2-адренорецепторами субклеточных фракций мембран коры головного мозга крыс в контроле (1) и при действии изопропилнорадреналина (2) и пропрано-лола (3). По оси абсцисс — концентрация [3Н]ИХ821002 (нМ), по оси ординат — количество мест, связанных лигандом (Ь, фмоль/мг белка). Параметры связывания в контрольном опыте = 1.80 ± ± 0.03 нМ, Бтах = 5.64 ± 0.04 фмоль/мг белка, п = 2; на фоне изопропилнорадреналина — Кл = 3.57 ± ± 0.04 нМ, Бтах = 12.32 ± 0.11 фмоль/мг белка, п = 2; на фоне пропранолола — К<ц = 0.58 ± 0.85 нМ, Кй2 = 3.66 ± 0.18 нМ, Бт1 = 1.83 ± 0.25 фмоль/мг белка, Бт2 = 9.38 ± 0.19 фмоль/мг белка, п = 2.
ингибитора, снижающую связывание лиганда в 2 раза при его концентрации равной Кй. I — концентрация ингибитора, Кйс — константа диссоциации в контроле, Кйе — константа диссоциации в эксперименте, Бтахс и Бтахе — количество активных рецепторов в контроле и в эксперименте соответственно [16].
РЕЗУЛЬТАТЫ
График специфического связывания [3Н]ЯХ821002 а2-адренорецепторами субклеточных фракций мембран коры головного мозга крыс представляет собой типичную кривую
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.