УДК 576.314.6.088.6+612.11.612.82.015
АГОНИСТЫ И АНТАГОНИСТЫ СЕРОТОНИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ -МОДУЛЯТОРЫ АКТИВНОСТИ агАДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ МЕМБРАН
КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС
© 2012 г. Л. А. Нестерова, Б. Н. Манухин*
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 26; факс 8 499 135 80 12, *электронная почта: manukhinb@mail.ru Поступила в редакцию 20.09.2011 г.
Исследовано влияние активации и ингибирования серотониновых рецепторов серотонином (5-НТ) и миансерином на связывание а^адренорецепторами специфического неселективного антагониста [3Н]празозина в субклеточных фракциях мембран коры головного мозга крыс. Установлено, что лиганд-рецепторное взаимодействие а^адренорецепторов соответствует модели: один пул рецепторов и присоединение двух молекул лиганда к одному рецептору. Параметры связывания [3Н]празозина — Кй = 1.85 ± 0.16 нМ, Втах = 31.1 ± 0.3 фмоль/мг белка, п = 2. При активации 5-НТ-рецепторов серотонином изменяется характер связывания лиганда — определяются два пула рецепторов с параметрами: Кй1 = 0.61 ± 0.04, Кй2 = 3.82 ± 0.15 нМ, Вт1 = 6.6 ± 0.7, Вт2 = 25.6 ± 0.4 фмоль/мг белка, п = 2. Чувствительность высокоаффинного пула рецепторов возрастает в 3 раза, низкоаффинного — снижается в 2 раза по сравнению с контролем. Величина максимальной реакции (Втах) не изменяется. При ингибировании 5-НТ-рецепторов миансерином связывание радиоактивного лиганда с а^-адренорецепторами происходит по той же модели, что и в контроле. Чувствительность к [3Н]празозину а^-адренорецепторов снижается в 2 раза (К = 3.97 ± 0.12 нМ), а их концентрация возрастает (Втах = 40.0 ± 0.5 фмоль/мг белка). Предполагается, что а^-адренорецепторы в субклеточных фракциях мембран головного мозга крыс существуют в виде димеров. Выявлено модулирующее действие серотонина и миансерина на связывание [3Н]празозина специфического антагониста а^адренорецепторами, которое проявляется в изменении параметров и общего характера ли-ганд-рецепторного взаимодействия.
Ключевые слова: мембраны коры головного мозга крыс, связывание, а^-адренорецепторы, [3Н]празозин, серотонин, миансерин, димеры.
Адренергическая и серотонинергическая системы реципрокно взаимодействуют на уровне нервных клеток и специфических рецепторов. Так, повышение активности адренергических нейронов через а^постсинаптические адренорецепторы влияет на серотонинергические нейроны [1]. Ингибиторы нейронального захвата серотонина снижают также включение норадреналина в адренер-гические нейроны [2]. Неселективный антагонист р-адренорецепторов басиндолол активирует серо-тониновые рецепторы сердечно-сосудистой системы и ингибирует агадренорецепторы [3]. Антагонист серотониновых рецепторов миансерин увеличивает диастолическое давление, которое регулируется через адренорецепторы [4]. Лиганды 1-3 диоксолановой структуры могут связываться с а1-адрено- и 5-НТ(1А)-рецепторами [5].
Приведенные данные свидетельствуют о существовании взаимодействия адренергической и се-ротонинергической нейротрансмиттерных систем. Для радиолигандных экспериментов оно
более вероятно на уровне мембраны клетки. Можно предположить, что присоединение ней-ротрансмиттера к своему рецептору аллостериче-ски изменяет активность других рецепторов, модулируя физиологические и биохимические реакции клеток.
Задачей работы было изучение действия агони-ста и антагониста серотониновых рецепторов — серотонина и миансерина, на кинетику связывания специфического неселективного антагониста а1-адренорецепторов [3Н]празозина в субклеточных фракциях мембран коры головного мозга крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проводили на субклеточных фракциях синаптосомальных мембран коры головного мозга крыс-самцов линии Вистар (210—250 г), которые выделяли по методу Непп, Непп, 1982 [6] с некоторыми модификациями. Готовые мембранные препараты хранили при —70°С в течение
259
3*
3 нед. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [7], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (Sigma). Связывание радиоактивного лиганда проводили в инкубационной среде с последующим отмыванием мембран от несвязанного лиганда на стеклово-локнистых фильтрах GF/B (Whatman). Объем инкубационной среды составлял 100 мкл — 50 мкл суспензии мембран, буфер трис-HCl 50 мМ, pH 7.4, немеченый вытеснитель празозин, антагонист серотониновых рецепторов и радиоактивный лиганд [3Н]празозин. Реакцию останавливали добавлением 1 мл холодного буфера (0°С). Параметры связывания лиганда с а1-адренорецепторами определяли с использованием специфического неселективного антагонист [3Н]празозина (77 Ки/мМ Am-ersham, Великобритания) в концентрации 0.33— 14.85 нМ. Специфическое связывание радиоактивного лиганда оценивали по разнице между общим и неспецифическим связыванием в присутствии нерадиоактивного лиганда — празозина в концентрации 10 мкМ. В качестве агониста и антагониста 5-НТ-рецепторов использовали серо-тонин и миансерин (Sigma) в концентрации 10 мкМ. Смесь инкубировали в течение 30 мин при 22°С. Вещества вводили в инкубационную среду за 20 мин до добавления [3Н]празозина.
Закономерности связывания антагониста со специфическими рецепторами определяли с использованием математических и графических методов анализа лиганд-рецепторных реакций [8]. Взаимодействие адренорецепторов изолированных мембран коры головного мозга крыс со специфическим радиоактивным антагонистом описывается уравнениями для одного или двух пулов рецепторов. Действие веществ анализировали с использованием 10 математических моделей связывания лиганда рецептором [9]. Модели: I — один пул рецепторов с рассчитанными параметрами Bmax, Kd и заданной величиной n = 1; II — один пул рецепторов с рассчитанными параметрами Bmax, Kd и заданной величиной n = 2; III — один пул рецепторов с рассчитанными параметрами Bmax, Kd, n; IV — два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Bm1, Kd1, Bm2, Kd2 и заданной величиной n1 = n2 = 1; V — два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Bm1, Kd1, n1 и Bm2, Kd2, n2 (n1 = n2); VI — два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Bm1, Kd1, Bm2, Kd2 и заданной величиной n1 = n2 = 2; VII — два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Bm1, Bm2, Kd1, Kd2 и заданными величинами n1 = 1, n2 = 2; VIII — два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Bm1, Kd1, n1 и Bm2, Kd2, Щ (n1 ф n2); IX -два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Bm1, Bm2, Kd1 = Kd2, и заданными величинами n1 = 1 и n2 = 2; X - два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Bm1, Bm2, Kd1 = Kd2 и n1 ф n2. Теоретически возможны и другие более сложные
модели лиганд-рецепторного взаимодействия, но их применение пока не давало удовлетворительных результатов.
Основные параметры лиганд-рецепторного взаимодействия - Kd, Bmax, Kdl, Kß, Bml, Bm2, и nb n2 рассчитывали с помощью компьютерной программы "SigmaPlot" по уравнениям (1) и (2).
b = [(Bmax^П)/ (К + An)], (1)
b = [(BmlAnl)/( Kl + Anl)] +
+ [(BmiAn2)/(K2 + лп2)],
где b — количество связанного лиганда, Bmax — количество мест связывания лиганда с константой диссоциации Kd; Bm1 и Bm2 — количество мест связывания лиганда в высоко- и низкоаффинном пулах рецепторов в одной эффекторной системе (Bmax = Bm1 + Bm2) с константами диссоциации Kd1 и Kd2 и коэффициентом Хилла n1, n2; [A] — концентрация лиганда в среде.
Эффективность связывания лиганда с рецепторами определяли по уравнению:
E = Bmax/2Kd. (3)
Эффективность (Е) — интегральный показатель, количественно характеризующий величину связывания лиганда при его концентрации, равной Kd (фмоль/мг белка/нМ). На рис. 1, 2 и 3 приведены данные конкретных опытов, а в табл. 1 — средние результаты экспериментов. Теоретические кривые строили по уравнениям (1) и (2). На теоретические кривые нанесены экспериментальные точки. В опытах было по 7—9 точек, каждая с трехкратным повтором. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (р < 0.05). Все значения представлены как средние арифметические и стандартные ошибки средней (M ± SEM).
Для количественной оценки влияния веществ на основные параметры лиганд-рецепторного взаимодействия (Kd или Bmax) рассчитывали их концентрации активации и ингибирования по уравнениям [10]:
AC50 = (AKdC)/(KdC — Kde), (4)
AC50 = (ABmaxc)/(Bmaxe — Bmaxc), (5)
IC50 = (IKdc)/(Kde — Kdc), (6)
IC50 = (IBmaxc)/(Bmaxc — Bmaxe), (7)
где показатели AC50 и IC50 для уравнений (4), (6) соответствуют концентрации вещества, повышающего или снижающего активность рецепторов (снижение и повышение Kd в 2 раза), соответственно, а AC50 и IC50 для уравнений (5), (7) соответствуют концентрации вещества, повышающего и снижающего количество (Bmax) рецепторов в 2 раза. Общий эффект веществ на связывание
[3Н]празозина определяли по уравнениям, включающим оба основных параметра (Кл и Втах):
АС50 = А[(КасВтахе)/(К(1сВтахе — К11еВтахс)], (8) 1С50 = Л(Кс1сВтахе)/(Кс1еВтахс — Кс1сВтахе)]. (9)
РЕЗУЛЬТАТЫ
Установлено, что взаимодействие лиганда с а^ адренорецепторами мембран коры головного мозга крыс в контроле соответствует модели (II) с одним, а в эксперименте — с одним или двумя пулами рецепторов (II, VI) и присоединением двух молекул лиганда к рецептору (п = 2) (уравнения (1), (2)).
График специфического связывания [3Н]празо-зина агадренорецепторами изолированных мембран коры головного мозга крыс представляет собой типичную кривую насыщения (рис. 1, 1). Математический анализ экспериментальных данных показал, что наименьшие ошибки параметров получены при расчете по уравнению (1), модели (II) лиганд-рецепторного взаимодействия, предполагающей присоединение двух молекул лиганда к одному рецептору и включающей один пул рецепторов (табл. 1). Графический анализ экспериментальных данных в контроле с помощью уравнения (10),
(b/A2) = [(Bm
x)/( K ) ] - [b/ ( Kd );
(10)
линеаризированной формы уравнения (1), в координатах (Ь; Ь/А2) также показывает существование одного гомогенного пула а1-адренорецепто-ров (рис. 3, 1). Экспериментальные точки на графике расположены на прямой линии (линейной регрессии). Для подтверждения соответствия полученным данным параметров, рассчитанных по уравнениям
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.