УДК 576.314.6.088.6+612.11.612.82.015
АГОНИСТЫ И АНТАГОНИСТЫ СЕРОТОНИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ -МОДУЛЯТОРЫ АКТИВНОСТИ а2-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ МЕМБРАН
КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС
© 2013 г. Л. А. Нестерова, Б. Н. Манухин
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 26; электронная почта: manukhinb@mail.ru, nesterova54@gmail.com Поступила в редакцию 19.03.2013
Изучено влияние активации и ингибирования серотониновых рецепторов серотонином (5НТ) и миансерином на связывание специфического неселективного антагониста а2-адренорецепторов [3Н]КХ821002 в мембранах коры головного мозга крыс. Установлено, что лиганд-рецепторное взаимодействие а2-адренорецепторов соответствует модели один пул рецепторов и присоединение двух молекул лиганда к одному рецептору. Параметры связывания [3Н]КХ821002 — Ка = 1.57 ± 0.27 нМ, Втах = 7.24 ± 1.63 фмоль/мг белка, п = 2. При активации 5НТ-рецепторов серотонином изменяется характер связывания лиганда — определяются два пула рецепторов с параметрами: Кл = 0.82 ± 0.06, Ка2 = 2.65 ± 0.22 нМ, БП1 = 1.65 ± 0.23, В^ = 4.20 ± 0.11 фмоль/мг белка, п = 2. Чувствительность высокоаффинного пула возрастает по сравнению с контролем, низкоаффинного — снижается. Общее количество рецепторов — величина максимальной реакции (Втах) — снижается на 20%. При ин-гибировании 5НТ-рецепторов миансерином изменяется также характер связывания радиоактивного лиганда с а2-адренорецепторами — определяются два пула рецепторов с параметрами: Хл = 0.48 ± ± 0.09, К2 = 3.79 ± 0.71 нМ, В1 = 0.63 ± 0.17, В2 = 4.75 ± 0.21 фмоль/мг белка. Чувствительность рецепторов высокоаффинного пула повышается по отношению к контрольному значению, низкоаффинного — снижается. Общее количество рецепторов (Втах) снижается на 26%. Предполагается, что а2-адренорецепторы в мембранах головного мозга крыс существуют в виде димеров. Выявлено модулирующее действие серотонина и миансерина, которое проявляется изменением общего характера и параметров связывания специфического антагониста а2-адренорецепторами [3Н]КХ821002.
Ключевые слова: мембраны коры головного мозга крыс, связывание, антагонист а2-адренорецепто-ров [3Н]КХ821002, серотонин, миансерин, димеры.
DOI: 10.7868/S0233475513040063
В регуляторной системе организма одновременно действуют различные биологически активные соединения — нейротрансмиттеры, гормоны и другие, которые связываются не только со своими специфическими рецепторами, но могут ал-лостерически модулировать активность других эффекторных систем. Взаимодействие различных регуляторных систем (cross-talk) привлекает все большее внимание. Показана функциональная взаимосвязь между серотонинергической и адренергической системами. Один из основных нейромедиаторов центральной нервной системы — серотонин (5-гидрокситриптамин; 5-HT) — регулирует поведение, агрессию, настроение, восприятие боли и тревожность [1]. 5-HT участвует в работе вегетативной нервной системы и сердечнососудистой системы, в агрегации тромбоцитов, росте гладких мышц матки, сосудов и функционировании желудочно-кишечного тракта [2—4]. Катехоламинергические системы головного моз-
га модулируют соматические и висцеральные рефлексы, участвуют в регуляции циклов сна— бодрствования, в контроле температуры тела, трофических влияний. Через а-адренорецепторы осуществляется регуляция адренергических процессов в центральной и периферической нервных системах. Модулирующие эффекты при активации и ингибировании а-адренорецепторов обусловлены их взаимодействием (cross-talk) с другими регуляторными системами. Серотониновые и адренергические рецепторы реципрокно взаимодействуют на уровне клеток и клеточных термина-лей. Так, ингибиторы обратного захвата серотонина снижают транспорт норадреналина в нейроны [5]. Неселективный блокатор p-адренорецепторов ба-синдолол активирует серотониновые рецепторы сердечно-сосудистой системы и ингибирует а1-ад-ренорецепторы [6]. Антагонист серотониновых рецепторов миансерин повышает диастолическое давление, которое регулируется через а-адрено-
рецепторы [7]. Новый класс лигандов 1—3 диок-солановой структуры могут связываться с а1-ад-рено- и 5-НТ(1А)-рецепторами [8]. Серотонин изменяет параметры связывания [3H]RX821002 с а2-адренорецепторами в мембранах коры головного мозга цыплят [9]. [3H]8-OH-DPAT, агонист рецепторов 5-НТ(1А/7), также связывается с а2А-адренорецепторами мозга мышей [10]. Этот ли-ганд увеличивает венозный тонус крыс через активацию а2-адренорецепторов [11].
Приведенные данные свидетельствуют о взаимодействии серотонинергических и адренергиче-ских нейротрансмиттерных систем. Можно предположить, что присоединение нейротрансмитте-ра к своему рецептору аллостерически изменяет активность других рецепторов, модулируя физиологические и биохимические реакции клеток.
Задачей нашей работы было изучение модулирующего действия серотонина и трициклического антидепрессанта миансерина — антагониста серо-тониновых рецепторов, на кинетику связывания специфического антагониста [3H]RX821002 а2-ад-ренорецепторами в мембранах клеток коры головного мозга крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проводили на мембранах коры головного мозга крыс-самцов линии Вистар (210—250 г), которые выделяли по методу Henn S.W. и Henn F.A. с некоторыми модификациями [12, 13]. Готовые мембранные препараты хранили при —70°С в течение 3 нед. Концентрацию белка определяли по методу Лоури, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (Sigma) [14]. Связывание радиоактивного лиганда [3H]RX821002 проводили в инкубационной среде с последующим отмыванием мембран от несвязавшегося лиганда на стекловолокнистых фильтрах GFB [15]. Объем инкубационной среды составлял 50—100 мкл суспензии мембран, 50 мМ трис-HCl-буфер, pH 7.4, "холодный" вытеснитель, агонист или антагонист серотониновых рецепторов и радиоактивный ли-ганд. Реакцию останавливали добавлением 1 мл холодного буфера (0°С). Параметры связывания лиганда с а2-адренорецепторами определяли с использованием специфического неселективного антагониста [3H]RX821002 (Amersham, Великобритания, 77 Ки/мМ) в концентрации 0.33— 6.60 нМ. Специфическое связывание определяли по разнице между общим и неспецифическим связыванием в присутствии нерадиоактивного лиганда — раувольфсцина в концентрации 10 мкМ. В качестве агониста и антагониста 5HT-рецепторов использовали серотонин и миансерин (Sigma) в концентрации 10 мкМ. Вещества вводили в инкубационную среду за 20 мин перед добавлением [3H]RX821002. Реакцию связывания лиганда с ре-
цепторами проводили в течение 30 мин при 22°С. Общее время инкубации составило 50 мин.
Для определения закономерностей связывания антагонистов со специфическими рецепторами использовали математические и графические методы анализа лиганд-рецепторных взаимодействий [16]. Ранее теоретически и экспериментально было показано, что взаимодействие специфических радиоактивных антагонистов адре-норецепторов с изолированными мембранами коры мозга крыс описывается уравнениями для одного или двух пулов рецепторов. Действие каждого из исследованных веществ анализировали с использованием 10 математических моделей связывания лиганда рецептором [17]. Установлено, что взаимодействие лиганда с а2-адренорецепто-рами мембран коры головного мозга крыс в контроле соответствует модели с одним, а в эксперименте с двумя пулами рецепторов и присоединением двух молекул лиганда к рецептору:
b = [(BnaxAOA К +An)], (1)
b = [(BmA^/Kl + An1)] + [(BmA"2)/(K22 + An2)], (2)
где b — количество связанного лиганда; Bmax— количество мест связывания лиганда с константой диссоциации Kd; Bm1 и Bm2 — количество мест связывания лиганда в высоко- и низкоаффинном пулах рецепторов в одной эффекторной системе с константами диссоциации Kd1 и Kd2 и коэффициентом Хилла n1 и n2; [A] — концентрация лиганда в среде. Основные параметры лиганд-рецептор-ного взаимодействия - Kd, Bmax, K^, Kd2, Bm1, Bm2, и n1, n2 рассчитывали с помощью компьютерной программы SigmaPlot. Эффективность связывания лигандов с рецепторами оценивали по уравнению:
E = Bmax/2Kd, (3)
где эффективность (Е) (фмоль/мг белка/нМ) [14] — интегральный показатель, количественно характеризующий величину связывания лиганда при его концентрации, равной Kd. На рис. 1, 2 и 3 приведены данные конкретных опытов, а в таблице — средние результаты. Теоретические кривые строили по уравнениям (1) и (2). На теоретические кривые нанесены экспериментальные точки. В опытах использовали по 7—9 точек, каждая в трехкратной повторности. Статистическую значимость различий оценивали с использованием критерия Стьюдента (р < 0.05). Все значения представлены как средние арифметические и стандартные ошибки средней (M ± SEM).
РЕЗУЛЬТАТЫ
График специфического связывания [3H]RX821002 а2-адренорецепторами изолиро-
ванных мембран коры головного мозга крыс представляет собой типичную кривую насыщения (рис. 1, кривая 1). Математический анализ экспериментальных данных показал, что наименьшие ошибки параметров получены при расчете по уравнению (1), модели лиганд-рецептор-ного взаимодействия, предполагающей присоединение двух молекул лиганда к одному рецептору и включающей один пул рецепторов (таблица). Графический анализ экспериментальных данных с помощью уравнения (4), линеаризированной формы уравнения (1), в координатах (Ь; Ъ/А2) также показывает существование одного гомогенного пула а2-адренорецепторов (рис. 2, кривая 1):
(Ь/А2) = [(^тах)/(К2)] - [Ь/(К2)]. (4)
Экспериментальные точки на графике расположены на прямой линии. Для подтверждения соответствия полученным данным параметров, рассчитанных по уравнениям (1) и (4), проведены теоретические кривые, с которыми хорошо совпадают экспериментальные точки (рис. 1, кривая 1 и рис. 2, кривая 1).
Серотонин, агонист 5НТ-рецепторов, вызывает изменения параметров связывания специфического антагониста [3Н]КХ821002 и общего характера взаимодействия лиганда с а2-адреноре-цепторами (таблица). Связывание лиганда с адренорецептором происходит согласно модели: два пула рецепторов, присоединение двух молекул лиганда к рецептору. При активации 5НТ-ре-цепторов, в высоко
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.