научная статья по теме АГОНИСТЫ -, -ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОДУКЦИИ IL-2, IL-4 И IFN- КЛЕТКАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ IN VITRO Биология

Текст научной статьи на тему «АГОНИСТЫ -, -ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОДУКЦИИ IL-2, IL-4 И IFN- КЛЕТКАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ IN VITRO»

ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2015, том 41, № 3, с. 112-117

УДК 615.276.2/.4.015.44

АГОНИСТЫ ц-, Ö-ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОДУКЦИИ IL-2, IL-4 И IFN-y КЛЕТКАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ IN VITRO © 2015 г. С. В. Гейн, С. П. Тендрякова

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Пермский государственный университет E-mail: gein@iegm.ru Поступила в редакцию 30.09.2014 г.

Установлено, что ß-эндорфин в нефракционированной лейкоцитарной суспензии стимулирует фи-тогемагглютинин-индуцированную продукцию IL-4 и не влияет на продукцию IFN-y. В культуре очищенных CD4+ Г-клеток ß-эндорфин не влияет на уровень IL-2, IL-4 и IFN-y, однако стимулирует продукцию IL-4 и угнетает продукцию IFN-y при добавлении к С04+-лимфоцитам моноцитов. Селективный 8-агонист DADLE усиливает фитогемагглютинин-индуцированную продукцию IL-4 в нефракционированной лейкоцитарной суспензии и в системе CD4+-лимфоциты + моноциты. Синтез IFN-y в присутствии DADLE, DAGO и Deltorphin II очищенными CD4+-лимфоцитами не изменяется, но при добавлении к CD4+-лимфоцитам моноцитов — снижается. ß-эндорфин и ц-агонист DAGO усиливают продукцию IFN-y стимулированными нейтрофилами. На продукцию IFN-y CD8+-лимфоцитами ß-эндорфин не влияет. Таким образом, опиоидные пептиды оказывают преимущественно 7h2-поляризующий эффект, опосредованный моноцитами, сдерживая развитие клеточного ответа угнетением IFN-y и стимулируя продукцию IL-4 через активацию 8-рецеп-тора. В то же время продукция IFN-y может усиливаться нейтрофилами при стимуляции ц-ре-цептора.

Ключевые слова: ß-эндорфин, IL-2, IL-4, IFN-y, опиатные рецепторы, лимфоциты.

Б01: 10.7868/80131164615030054

В настоящее время важная роль опиатных рецепторов, их эндогенных и синтетических лиган-дов в регуляции иммунных реакций не вызывает сомнений. Доказано наличие на клетках врожденного и адаптивного иммунитета ц,5,к-опиат-ных рецепторов, аналогичных экспрессируемым в ЦНС [1]. р-эндорфин — опиоидный пептид, взаимодействующий с ц- и 5-рецепторами [2]. Плотность ц- и 5-рецепторов на клетках иммунной системы существенно возрастает после антигенной или митогенной активации [3]. Показано, что р-эндорфин модулирует целый ряд важнейших функций, таких как пролиферация, секреция цитокинов, продукция активных форм кислорода и фагоцитоз [4]. Направленность его действия зависит от целого ряда факторов, таких как концентрация, условия для межклеточной кооперации, и от типа рецептора, преимущественно экспрессирован-ного на клетках [5].

Основными продуцентами ТН1/ТН2-цитоки-нов являются С^4+-клетки, которые дифферен-

цируются на две субпопуляции (ТН1/ТН2), различающиеся по профилю синтезируемых факторов. ТН 1-клетки продуцируют ШЫ-у, 1Ь-2 и ТЫЕ-а и участвуют в клеточно-опосредованном ответе, а ТН2-клетки продуцируют 1Ь-4,1Ь-5,1Ь-10,1Ь-13 и опосредуют гуморальный иммунный ответ. Клетки врожденного иммунитета, в частности, моноциты-макрофаги могут оказывать существенное влияние на ТН1/ТН2-дифференци-ровку лимфоцитов за счет продукции про- и противовоспалительных факторов. В продукции ШЫ-у, помимо С04-клеток могут принимать участие С08-клетки и нейтрофильные гранулоциты [6].

В настоящей работе нами проанализированы эффекты р-эндорфина и селективных агонистов опиатных рецепторов на продукцию ТХ-4, 1Ь-2, ШЫ-у СБ4--лимфоцитами, установлена роль моноцитов в регуляции секреторной активности СМ-клеток, проведена оценка влияния опио-идных пептидов на продукцию ШЫ-у СБ8-

лимфоцитами и нейтрофилами периферической крови.

МЕТОДИКА

Для получения нефракционированной лейкоцитарной суспензии гепаринизированную венозную кровь отстаивали в течение 2 ч при 37°С. После отстаивания верхний слой плазмы с лейкоцитами снимали и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин. Полученный осадок ресуспен-дировали в 2 мл полной питательной среды (ППС), которую готовили на основе RPMI 1640 (ICN, США) с добавлением 10 mM HEPES ("Sigma", США), 2 mM Z-глутамина ("Sigma", США), 100 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, "Биолот", Россия).

Мононуклеарные клетки получали на градиенте плотности фиколл-верографин с плотностью р = 1.077. Фракцию моноцитов выделяли механическим способом. Для этого охлажденную суспензию мононуклеаров ресуспендировали в 5 мл ППС и наносили на стерильную стеклянную чашку Петри, которую помещали в термостат и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Неадгези-ровавшиеся клетки удаляли, а адгезировавшиеся клетки — моноциты — снимали резиновым шпателем, суспендировали в среде RPMI 1640, дважды отмывали и выдерживали в течение 1 ч при 4°С с целью снятия активации.

Выделение фракции нейтрофилов производили на градиенте плотности фиколл-верографин (р = 1.077) путем наслаивания верхнего слоя плазмы крови с лейкоцитами. Центрифугирование осуществляли при 1500 об/мин в течение 40 мин. Осевшие на дно гранулоциты суспендировали в среде RPMI 1640, дважды отмывали и выдерживали в течение 1 ч при 4°С с целью снятия активации, вызванной выделением. Чистота выделения нейтрофилов оценивалась визуально и составила 85—95%.

С^4+-клетки и С^8+-клетки выделяли при помощи наборов магнитных бус Dynabeads M-450 CD4 и Dynabeads CD8 ("Invitrogen", США). К лейкоцитарной суспензии 1—5 х 107 клеток/мл добавляли 2 х 107 частиц. После инкубации в течение 20 мин при 2—8°С в перемешивающем устройстве пробирку с суспензией помещали в магнитный держатель на 2—3 мин. Выделенные клетки 5 раз промывали фосфатным буфером с 2% ЭТС и ре-суспендировали в ППС. Моноциты вносили в лунки следующим образом: нефракционирован-ную лейкоцитарную суспензию (106 клеток/мл) помещали в лунки планшета, инкубировали 1 ч при 37°С, затем супернатант с неадгезированны-ми клетками удаляли, а к адгезированным на стенках лунки моноцитам добавляли 2 х 105 CD4+-клеток или CD8+-клеток в 0.2 мл ППС.

Клетки культивировали в концентрации 106 клеток/мл в 96-луночных круглодонных планшетах во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С в течение 24 ч или 48 ч в присутствии липополиса-харида (ЛПС, Escherichia coli O26 : B6, "Sigma", США) в концентрации 0.1 или 2.5 мкг/мл фитоге-магглютинина (ФГА, "Sigma", США). Агонист |/5-опиатных рецепторов ß-эндорфин ("Sigma", США) использовали в концентрациях 10-7— 10-11 М, |-агонист DAGO ([d-Ala2,N-Me-РИе4^1у5-о1]-энкефалин, "Sigma", США) в концентрации 10-8 М; 5-агонист DADLE ([d-A1a2,d-Leu5]-энкефалин, "Sigma", США) в концентрации 10-7 М, 52-агонист Deltorphin II ([Tyr-d-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly] -амид, " Sigma", США) в концентрации 10-7 М. Выбор концентраций агонистов основан на ранее проведенных исследованиях [7]. Супернатанты клеточных культур собирали в пробирки Эппендорф, центрифугировали и хранили в замороженном состоянии при —20°С.

Определение концентрации исследуемых ци-токинов (IFN-y, IL-4, IL-2) в супернатантах клеточных культур производили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем ЗАО "Вектор-Бест" (Новосибирск, Россия) в соответствии со стандартной методикой, предложенной производителем.

Статистический анализ проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа для парных данных и критерия Фишера наименьшей значимой разницы для анализа зависимости доза-эффект и парного t-критерия Стьюдента для оценки эффектов ß-эндорфина и селективных агонистов. Все данные на рисунках представлены в виде средней и ее стандартной ошибки (M ± m).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При оценке зависимости доза-эффект установлено, что р-эндорфин в концентрациях 10-7— 10-8 М стимулирует ФГА-индуцированную продукцию /£-4 и не влияет на синтез ^^у и 1£-2 (таблица).

Как видно из рис. 1, р-эндорфин, усиливая продукцию 1£-4 во фракции лейкоцитов, не влияет на его уровень в культуре С^4+-клеток. Добавление к СМ+-лимфоцитам моноцитов приводит к стимуляции продукции 1£-4 под воздействием р-эндорфина до уровня нефракционированных культур. Уровень продукции ^^у очищенными С^4+-лимфоцитами в присутствии р-эндорфина не изменяется. Однако при добавлении к СБ4+-лимфоцитам моноцитов р-эндорфин статистически значимо снижает синтез ^N-7. На продук-

114

ГЕЙН, ТЕНДРЯКОВА

А Б В

Фракция С04+-лимфоциты Фракция СЙ4+-лимфоциты Фракция С04+-лимфоциты

лейкоцитов СХ>4+-лимфоциты и моноциты лейкоцитов СХ>4+-лимфоциты и моноциты лейкоцитов СХ>4+-лимфоциты и моноциты

пг/мл * 12

К

ч я

m i

св Н

(U —

К

ч я

m i

св Н

(U —

К

пг/мл 30

ч я

m i

се Н

о —

15

К

ч я

m i

се Н

о —

К

ч я

m i

се Н

о —

К

пг/мл 200

ч я

m i

се Н

о —

100

К

ч я

m i

се Н

о —

К

ч я

m i

се Н

о —

К

ч я

m i

се Н

о —

0

0

0

Рис. 1. Влияние Р-эндорфина на фитогемагглютинин (ФГА)-индуцированную продукцию 1Ь-4 (А), 1Ь-2 (Б) и №Ы-у (В) С04+-лимфоцитами (п = 9). По оси абсцисс — экспериментальное воздействие, К — контроль бета-энд — Р-эндор-фин 10-7 М, по оси ординат — концентрация цитокина (пг/мл); * — р < 0.05 к контролю.

цию IL-2 С^4+-лимфоцитами эффектов пептида не зарегистрировано.

Таким образом, эффекты ß-эндорфина на ФГА-индуцированную продукцию IL-4 и IFN-y С^4+-лимфоцитами зависят от присутствия фракции моноцитов в культурах.

На продукцию IL-2 селективные агонисты опиатных рецепторов не влияли. Селективный 5-агонист DADLE усиливал ФГА-индуцированную продукцию IL-4 в нефракционированной лейкоцитарной суспензии и в системе СD4+-лимфоци-ты + моноциты. Селективный ц-агонист DAGO и высокоселективный 52-агонист Deltorphin II не оказывали влияния на синтез IL-4 (рис. 2).

Синтез IFN-y в присутствии опиатных агони-стов очищенными СD4+-лимфоцитами не изменялся (рис. 2). Но при добавлении к СD4+-лим-фоцитам моноцитов проявлялся хорошо выраженный угнетающий эффект DADLE, DAGO и Deltorphin II. В то же время в нефракционирован-ной лейкоцитарной суспензии в присутствии селективного 5-агониста наблюдалось угнетение продукции IFN-y, а в присутствии ц-агониста — стимуляция.

Наблюдаемое угнетение уровня IFN-y в системе "СD4+-лимфоциты—моноциты", но не в нефракционированной лейкоцитарной суспензии, может объясняться рядом причин. Поскольку

Влияние ß-эндорфина на спонтанную и ФГА-индуцированную продукцию IL-2, IL-4 и IFN-y в нефра

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»