МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 1, с. 133-135
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.222
АКТИВАЦИЯ АУТОЛИТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИИ STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 33 НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМ КАТИОННЫМ ПЕПТИДОМ ВАРНЕРИНОМ © 2010 г. В. П. Коробов1, Т. В. Полюдова, Л. Б. Филатова, Л. М. Лемкина, Н. В. Панькова
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь Поступила в редакцию 02.06.2009 г.
Механизмы антимикробного действия низкомолекулярных катионных пептидов, синтезируемых некоторыми бактериями [1], до сих пор остаются изученными недостаточно. Имеющиеся данные позволяют рассматривать в качестве мишеней этих соединений внутриклеточные системы синтеза биополимеров и мембранные структуры бактерий. Атака пептидами клеточных мембран приводит к образованию их комплексов с липидом II с формированием короткоживущих пор и нерегулируемых ионных каналов. Следствием обусловленных действием антибактериальных пептидов мембранных нарушений является быстрое снижение электрической компоненты мембранного потенциала и внутриклеточного уровня АТФ, ведущие к запуску аутолитического расщепления пептидогликана и осмотической гибели бактериальной клетки в незащищенной среде [1].
Пептидогликан является главным компонентом клеточных стенок грамположительных бактерий и той динамичной структурой, компоненты которой согласованно синтезируются и расщепляются в процессах роста и деления клеток. Главными катализаторами этих процессов являются различные гликан-и пептидгидролазы, арсенал которых в стафилококках составляют ^-ацетилмурамил-Ь-аланинамида-зы, ^-ацетилглюкозаминидазы, ^-ацетилмурами-дазы, эндопептидазы и трансглюкозидазы. Для ряда из них известны конкретные физиологические функции и генетическая детерминация. Предполагается, что гликангидролазы играют важную роль в таких клеточных процессах, как рост клеточных стенок, деление и разделение клеток, рециклинг муро-пептидов, индуцированный лизис клеток, выработка патогенных факторов [2]. Сохранение целостности бактериальных клеток в процессах их роста и деления обеспечивается жестким контролем проявления активности аутолитических гидролаз на транскрипционном уровне благодаря функционированию негативных и позитивных глобальных факторов регуляции и двухкомпонентных сигнальных систем [3, 4]. По завершению трансляционных событий активность аутолизинов модулируется
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: korobov@iegm.ru).
стрессовыми воздействиями, солями, действием протеаз [4]. Существенным фактором сдерживания аутолитических процессов является "иммобилизация" аутолизинов анионными молекулами тейхоевых и липотейхоевых кислот [5]. Диссоциация таких комплексов приводит к индукции лити-ческого расщепления полимеров бактериальных стенок.
Целью работы было проведение энзимографи-ческого анализа ферментов аутолитического комплекса, активность которых резко возрастает при развитии бактериолитического эффекта катион-ного пептида варнерина на бактерии Staphylococcus epidermidis 33.
В экспериментах бактерии выращивали на среде LB до середины фазы логарифмического роста (OD600 = 0.8). Клетки 30 мл культуры осаждали центрифугированием ("Sigma" 3К30, 10000 об/мин, 10 мин) и отмывали от среды роста 0.01 М Tris-HCl, рН 7.2. Осадок клеток ресуспендировали в этом же буфере до получения OD600 = 1.0. Активацию аутолиза инициировали добавлением к суспензиям отмытых клеток равных объемов тритона X-100 (0.2%) и варнерина (100 мкМ). Пробы инкубировали на шейкере Sertomat ("Sartorius", Германия) при 150 об/мин и 37°С в течение 4—5 ч. После завершения инкубации аликвоты проб (1 мл) центрифугировали в указанном режиме и супернатан-ты подвергали ренатурируемому электрофорезу в ПААГ [6], содержащем убитые кипячением и отмытые дистиллированной водой бактерии S. epidermidis 33 (1.6 мг сухих клеток/мл геля) в качестве субстрата для аутолизинов, выделяющихся в среду из клеток стафилококков во время бактериолизиса. Каждый образец исследовали в двух вариантах: 1 — с внесением фенилметилсульфонилфторида ("Sigma", США) до концентрации 100 мкМ для предотвращения протеолитического расщепления аутолизинов; 2 — без внесения ингибитора протеаз. После электрофоретического разделения гель отмывали дистиллированной водой в течение 30 мин, помещали в ренатурирующий буфер, содержащий 50 мМ MES-NaOH, pH 6.0 и 0.1% тритон X-100, инкубировали в течение 16 ч при 37°С, а затем промывали водой, окрашивали
134
КОРОБОВ и др.
OD6oo 0.6
0 1 2 3 4 5 6
Время, ч
Рис. 1. Литическое действие тритона Х-100 и варне-рина на бактерии Б. epidermidis 33: 1 — контроль; 2 — тритон Х-100; 3 — варнерин.
0.1% метиленовым синим в 0.01% КОН в течение 1 ч и вновь отмывали водой для проявления прозрачных зон лизиса клеток на синем фоне (нели-зированные клетки, окрашенные метиленовым синим).
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о выраженном литическом действии использованных концентраций как нейтрального детергента тритона Х-100, так и варнерина (рис. 1). Эффект детергента, определяемый по снижению оптической плотности суспензии, был заметно слабее в первые часы инкубации, однако на более поздних сроках инкубации клетки в обоих вариантах опытов практически полностью ли-зировались. Отсутствие у пептида каких-либо ферментативных свойств предполагает опосредован-ность его участия в бактериолитическом процессе, которое может быть связано с показанным нами ранее быстрым снижением электрической составляющей мембранного потенциала Ду при внесении варнерина в среду инкубации [7], либо с его активирующим влиянием на аутолизины.
Ситуация в некоторой степени проясняется при анализе результатов электрофоретического разделения обладающих пептидогликангидролаз-ной активностью белков, содержащихся в супер-натантах сред инкубации бактерий с литическими факторами — тритоном Х-100 или варнерином (рис. 2). Наибольшее многообразие аутолизинов обнаруживается в препарате, полученном при действии варнерина. Множественность гидролаз клеточных стенок характерна и для тритоновых авто-лизатов. Сравнение электрофоретических данных обнаруживает в лизатах бактерий, наряду с одинаковыми по подвижностям фракциями, и наличие полос пептидогликан-гидролаз, характерных только для одного из вариантов лизиса (отмечено стрел-
Рис. 2. Энзимографическое исследование аутолити-ческих ферментов, освобождающихся в среду при действии на бактерии различных литических факторов: 1, 2 — тритон Х-100; 3, 4 — варнерин; 5, 6 — инкубация в буфере 0.01 М Тто-HCl, рН 7.2; 2, 4, 6 — инкубация в присутствии ингибитора протеаз PMSF (100 мкМ). Стрелками указаны пептидогликан-гид-ролазы, специфически активируемые каждым из ли-зирующих факторов.
ками). Следовательно, пути активации аутолизинов клеточных стенок стафилококков тритоном Х-100 или варнерином имеют как общие черты (детер-гентное действие), так и некоторые отличия. Последние могут быть обусловлены диссоциацией, вызываемой катионными молекулами варнерина, существующих в клеточных стенках комплексов тейхоевых, тейхуроновых и липотейхоевых кислот с аутолизинами, что способствует освобождению последних и проявлению их специфической ферментативной активности.
Таким образом, сопоставление бактериолити-ческих эффектов неионного детергента тритона-Х-100 и катионного амфифильного пептида вар-нерина позволяет заключить, что одним из механизмов антибактериального действия пептида является активация аутолизинов атакуемых бактериальных клеток.
Выраженные солюбилизирующие свойства варнерина представляют отдельный интерес для проведения более глубоких исследований его де-тергентной активности в связи с перспективами использования пептидных детергентов в качестве источников нановезикул для векторного переноса различных биологически активных соединений в живых системах по типу "троянского коня".
МИКРОБИОЛОГИЯ том 79 № 1 2010
АКТИВАЦИЯ АУТОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ
135
Работа поддержана грантом РФФИ № 07-04-01546-а и Программой Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология".
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Nagao J., Asaduzzaman S.M., Aso Y., Okuda K., Na-kayama J., Sonomoto K. Lantibiotics: insight and foresight for new paradigm // J. Biosci. Bioeng. 2006. V 102. № 3. P. 139-149.
2. Shockman G.D., Barrett J.F. Structure, function, and assembly of cell walls of gram-positive bacteria // An-nu. Rev. Microbiol. 1983. V 37. P. 501-527.
3. Ingavale S.S., Van Wamel W., Cheung A.L. Characterization of RAT, an autolysis regulator in Staphylococcus aureus // Mol. Microbiol. 2003. V. 48. P. 1451-1466.
4. Liang X., Zheng L., Landwehr C., Lunsford D., Holmes D., Ji Y. Global regulation of gene expression by ArlRS, a two-component signal transduction regula-
tory system of Staphylococcus aureus // J. Bacterid. 2005. V. 187. P. 5486-5492.
5. Fedtke I., Mader D., Kohler T, Moll H., Nicholson G., Biswas R., Henseler K., Götz F., Zähringer U., Peschel A. A Staphylococcus aureus ypfP mutant with strongly reduced lipoteichoic acid (LTA) content: LTA governs bacterial surface properties and autolysin activity // Mol. Microbiol. 2007. V. 65. P. 1078-1091.
6. Sugai M., Akiyama T., Komatsuzawa Н., Miyake Y., Suginaka H. Characterization of sodium dodecyl sulfate-stable Staphylococcus aureus bacteriolytic enzymes by polyacrylamide gel electrophoresis // J. Bacteriol. 1990. V. 172. № 11. P. 6494-6498.
7. Коробов В.П., Титова А.В., Лемкина Л.М., Полюдо-ва Т.В., Панькова Н.В. Зависимость антибактериального эффекта поликатионного пептида варнерина от энергетического состояния клетки-мишени // Микробиология. 2005. T. 74. № 2. C. 166-171.
МИКРОБИОЛОГИЯ том 79 № 1 2010
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.