научная статья по теме АКТИВАЦИЯ CGMP-СПЕЦИФИЧНОЙ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ ПАЛОЧЕК СЕТЧАТКИ БЫКА КОМПЛЕКСОМ ТРАНСДУЦИН-GTP[S] В ДИАПАЗОНЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ КОНЦЕНТРАЦИИ Са2+ Биология

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 6, с. 443-445

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

УДК 577.3

АКТИВАЦИЯ cGMP-СПЕЦИФИЧНОЙ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ ПАЛОЧЕК СЕТЧАТКИ БЫКА КОМПЛЕКСОМ ТРАНСДУЦИН-GTP[S] В ДИАПАЗОНЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ КОНЦЕНТРАЦИИ Са2+ © 2014 г. О. В. Петрухин*, Т. Г. Орлова, А. Р. Незвецкий, Н. Я. Орлов

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 149290 Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3; *электронная почта:petrukhinoleg@rambler.ru Поступило в редакцию 08.07.2014 г.

Ключевые слова: фосфодиэстераза фоторецепепторов, активация трансдуцином, ионы кальция.

DOI: 10.7868/S0233475514060061

Основными элементами молекулярного усилителя, локализованного в наружных сегментах палочек (НСП) сетчатки позвоночных, являются рецептор света мембранный белок родопсин (Я), гетеротримерный ОТР-связывающий белок (О-белок) трансдуцин (О^ и исполнительный фермент сОМР-специфичная фосфодиэстераза (РЭБ) [1, 2]. Поглотившая квант света молекула родопсина (Я*) за время ее жизни в активном состоянии ^ ~ 1 с) последовательно взаимодействует с большим числом (102—103) молекул О^ индуцируя их переход из неактивного состояния (О^ОЭР) в активное (О1-ОТР) [3, 4]. Такой процесс ведет к активации значительного количества (102—103) молекул РЭБ и, как следствие, к гидролизу вторичного мессенджера сОМР [3, 4]. Падение концентрации сОМР инактивирует сОМР-регулируемые ионные каналы плазматической мембраны НСП [5] и в конечном итоге приводит к генерации электрического ответа фоторецептора.

В адаптированных к темноте НСП относительно высокая стационарная внутриклеточная концентрация свободных ионов Са2+(~100 нМ) поддерживается благодаря входу через сОМР-ре-гулируемые каналы [6, 7] и его откачке локализованной в плазматической мембране системой обмена Ш+-Са2+,К+ [8-10]. Инактивация сОМР-регулируемых каналов в ответ на свет подавляет вход ионов Са2+, тогда как система №+-Са2+,К+-обмена продолжает работу. Это проводит к быстрому (100—200 мс) падению концентрации Са2+ в НСП до наномолярных значений [11, 12].

Падение концентрации ионов Са2+ активирует (1) родопсинкиназу, многократно фосфорилиру-ющую Я* и тем самым блокирующую его способность активировать О^ (2) гуанилатциклазу, вос-

станавливающую концентрацию медиатора сОМРдо уровня, характерного для адаптированного к темноте состояния фоторецептора, и изменяет регуляторные характеристики cGMP-зависи-мых ионных каналов плазматической мембраны НСП (см. обзоры [13-15]).

Таким образом, изменение концентрации Ca2+ в цитоплазме НСП имеет принципиально важное функциональное значение. Поэтому в нашей работе была предпринята попытка изучить влияние ионов Са2+ на одну из стадий сложного многоэтапного процесса фототрансдукции - стадию взаимодействия активированного трансдуцина с сGMP-специфичной PDE. Для этого мы исследовали процесс активации PDE трансдуцином в комплексе с негидролизуемым аналогом GTP гу-анозин-5'-О-тиотрифосфатом (GTP[S]) в препаратах полностью обесцвеченных НСП сетчатки быка в широком диапазоне концентраций ионов Са2+ (100 мкМ-10 нМ). Использование полностью обесцвеченных НСП в отсутствие экзогенного АТР позволяло сохранить активирующую способность R* в течение длительного времени, а применение негидролизуемого аналога GTP (GTP[S]) исключало возможное влияние Са2+ на время жизни активного состояния трансдуцина.

Исследования проводили на препаратах НСП сетчатки быка, полученных при помощи метода, близкого к описанному ранее [16]. Метод характеризуется использованием одной и той же среды (раствор 40% (w/v) сахарозы, приготовленный на изотоническом буфере (25 мМ HEPES-NaOH, pH 8.0, 140 мМ NaCl, 3.5 мМ KCl, 2 мМ MgCl2, 0.5 мМ CaCl2)) на всех этапах выделения (гомогенизация сетчаток и последующая очистка НСП в результате двукратной флотации при 100000 g в течение 60 мин без промежуточных промывок

443

5*

444

ПЕТРУХИН и др.

а б

Кинетика гидролиза субстрата (10 мМ сАМР) РОБ в составе полностью обесцвеченных НСП ([И*] « 0.4 мг/мл) до и после ее активации комплексом О1>ОТР[8] при различной концентрации свободных ионов Са2+ («100 мкМ (а) и <10 нМ (б)).

изотоническим буфером). Метод позволяет в известной степени сохранить интактность плазматической мембраны НСП и тем самым предотвратить потерю водорастворимых белков. Очищенные НСП (^280/500 ~ 3.5—4.5) суспендировали в том же растворе сахарозы в конечной концентрации по родопсину ~5—10 мг/мл и хранили в темноте при —20°С в 0.5 мл пластиковых контейнерах.

Активность РЭБ в препаратах НСП измеряли рН-метрическим методом [17], регистрируя за-кисление среды, обусловленное появлением протонов в ходе реакции гидролиза 2 мМ еОМР или 10 мМ еАМР. Как известно [17], сАМР также является эффективным субстратом для РЭБ НСП (максимальная скорость гидролиза еАМР примерно в 2 раза меньше, чем для еОМР, а значение Км для еАМР составляет около 1—2 мМ). Начальное значение рН составляло 8.0, конечное значение было не ниже 7.8. В данном диапазоне изменение рН описывалось практически линейной функцией количества протонов, появившихся в результате реакции. Количество появившихся протонов определяли, титруя систему 100 мМ №ОИ.

Кинетику изменений рИ регистрировали с помощью малогабаритного (диаметр 3 мм) комбинированного рН-электрода Е5259 (81§ша-АЫг1еИ, США) и высокочувствительного рН-метра СРХ-2.1 (ИБП РАН), снабженного специально разработанным для данной задачи программным обеспечением. Использованный измерительный комплекс обладал чувствительностью около 0.001 рН при временном разрешении около 1 с.

Реакцию проводили в термостабилизирован-ных пластиковых кюветах объемом 0.3—0.5 мл при 30°С в среде, содержащей 50 мМ ИБРБ8-ШОИ,

рН 8.0, 100 мМ NaCl, 30 мМ MgCl2 и 100 мкМ CaCl2. Низкую концентрацию свободных ионов Са2+ (<10 нМ) обеспечивали добавлением в реакционную среду этиленгликольтетрауксусной кислоты (EGTA) до конечной концентрации 5 мМ. Концентрацию свободных ионов Са2+ рассчитывали согласно известной программе [18]. Препарат НСП добавляли в реакционную среду до конечной концентрации по родопсину ~0.4-2 мг/мл.

Непосредственно перед добавлением препараты НСП гомогенизировали с помощью шприца (объем 2 мл), пропуская 5 раз через иглу 0.5 мм, и полностью обесцвечивали светом с длиной волны >540 нм в течение 2 мин. Реакции инициировали добавлением сАМР или cGMP до конечных концентраций 10 и 2 мМ соответственно.

Спектральные измерения выполняли на спектрофотометре Cary 100 (Varian, США). Концентрацию R определяли по разности поглощения образцов НСП при 500 нм до и после их полного обесцвечивания оранжевым светом в присутствии гидроксиламина (NH2OH). Молярный коэффициент экстинкции родопсина при 500 нм принимали равным 40600 см-1 М-1.

На рисунке показаны типичные примеры кинетики гидролиза субстрата (10 мМ сАМР) фос-фодиэстеразой НСП до и после ее активации комплексом Gt-GTP[S] при концентрации свободных ионов Са2+ ~100 мкМ и <10 нМ. Видно, что в данных экспериментальных условиях исследуемые процессы не зависят от концентрации свободных ионов Са2+. Это означает, что как функционирование свободной PDE в составе НСП, так и все последующие процессы (активация Gt, взаимодействие комплекса Gt-GTP[S] с PDE и ее последующее функционирование в активном режиме) не зависят от концентрации свободных ионов Са2+ в физиологическом диапазоне изменений их концентрации в НСП.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Stryer L. 1986. Cyclic GMP cascade of vision. Annu. Rev. Neurosci. 9, 87-119.

2. Stryer L. 1991. Visual excitation and recovery. J. Biol. Chem. 266, 10711-10714.

3. Arshavsky VY, Lamb T.D., Pugh E.N., Jr. 2002. G protein and phototransduction. Annu. Rev. Physiol. 64, 153-157

4. Pugh E.N., Jr., Lamb T.D. 1993. Amplification and kinetics of the activation steps in phototransduction. Bio-chim. Biophys. Acta. 1141, 111-149.

5. Fesenko E.E., Kolesnikov S.S., Lyubarsky A.L. 1985. Induction by cyclic GMP of cationic conductance in plasma membrane of retinal rod outer segment. Nature. 313, 310-313.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ том 31 № 6 2014

AКТHВAЦHH cGMP-CПEЦHOHHHOH OOCOOflHЭCТEPAЗbI

445

6. Yau K.-W., Nakatani K. 1984. Cation selectivity of light-sensitive conductance in retinal rods. Nature. 309, 352-354.

7. Hodgkin A.L., McNaughton P.A., Nunn B.J. 1985. The ionic selectivity and calcium dependence of the light-sensitive pathway in toad rods. J. Physiol. 358, 447-468.

8. Yau K.-W., Nakatani K 1984. Electrogenic Na-Ca exchange in retinal rod outer segment. Nature. 311, 661663.

9. Hodgkin A.L., McNaughton P.A., Nunn B.J. 1987. Measurement of sodium-calcium exchange in salamander rods. J. Physiol. 391, 347-370.

10. Cervetto L., Lagnado L., Perry R.J., Robinson D.W., McNaughton P.A. 1989. Extrusion of calcium from rod outer segments is driven by both sodium and potassium gradients. Nature. 337, 740-743.

11. Yau K.-W, Nakatani K. 1985. Light-induced reduction of cytoplasmic free calcium in retinal rod outer segment. Nature. 313, 579-582.

12. McNaughton P.A., Cervetto L., Nunn B.J. 1986. Measurement of the intracellular free calcium concentration in salamander rods. Nature. 322, 261-263.

13. Pugh E.N., Jr., Lamb T.D. 2000. Phototransduction in vertebrate rods and cones: molecular mechanisms of amplification, recovery and light adaptation. In Handbook of Biological Physics. Eds Stavenga D.G., Pught J.E.N., de Grip W.J. Amsterdam: Elsevier Science B. V 183— 255.

14. Burns M.E., Arshavsky V.Y 2005. Beyond counting photons: Trials and trends in vertebrate phototransduc-tion. Neuron. 48, 387-401

15. Burns M.E., Pugh E.N., Jr. 2010. Lessons from photoreceptors: turning off G-protein signaling in living cells. Physiology (Bethesda). 25, 72-84.

16. Orlov N.Ya., Kalinin E.V., Orlova T.G., Freidin A.A. 1988. Properties and content of cyclic nucleotide phos-phodiesterase in photoreceptor outer segments of ground squirrel retina. Biochim. Biophys. Acta. 954, 325-335.

17. Yee R., Liebman P.A. 1978. Light-activated phosphod-iesterase of the rod outer segments. Kinetics and parameters of activation and deactivation. J. Biol. Chem. 253, 8902-8909.

18. http://maxchelat

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.