научная статья по теме АКТИВАЦИЯ ГЕНОВ RНОА И NКIRАS1 В ОПУХОЛЯХ ЛЕГКОГО АССОЦИИРОВАНА С ПОТЕРЕЙ МЕТИЛИРОВАНИЯ ЭТИХ ГЕНОВ И С МЕТИЛИРОВАНИЕМ ГЕНОВ РЕГУЛЯТОРНЫХ МИКРОРНК Химия

Текст научной статьи на тему «АКТИВАЦИЯ ГЕНОВ RНОА И NКIRАS1 В ОПУХОЛЯХ ЛЕГКОГО АССОЦИИРОВАНА С ПОТЕРЕЙ МЕТИЛИРОВАНИЯ ЭТИХ ГЕНОВ И С МЕТИЛИРОВАНИЕМ ГЕНОВ РЕГУЛЯТОРНЫХ МИКРОРНК»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 4, с. 568 - 581

УДК 575:599.9

АКТИВАЦИЯ ГЕНОВ RHOA И NKIRAS1 В ОПУХОЛЯХ ЛЕГКОГО АССОЦИИРОВАНА С ПОТЕРЕЙ МЕТИЛИРОВАНИЯ ЭТИХ ГЕНОВ И С МЕТИЛИРОВАНИЕМ ГЕНОВ РЕГУЛЯТОРНЫХ микроРНК*

© 2015 Э.А. Брага12**, В.И. Логинов12, И.В. Пронина12, Д.С. Ходырев3, С.В. Рыков4, А.М. Бурденный1, М.В. Фридман5, Т.П. Казубская6, А.А. Кубатиев1, Н.Е. Кушлинский6

1 Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии, 125315Москва; факс: +7(495)601-2366, электронная почта: eleonora10_45@mail.ru

2 Медико-генетический научный центр РАМН, 115478 Москва; факс: +7(499)324-0702, электронная почта: karpukhin@med-gen.ru

3 Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России,

115682Москва; факс: +7(495)395-6430, электронная почта: DmKh8@mail.ru

4 Государственный научно-исследовательский институт генетики

и селекции промышленных микроорганизмов, 117545 Москва; факс: +7(495)315-0501, электронная почта: genetika@genetika.ru 5 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 117971 Москва; факс: +7(499)135-6213, электронная почта: iogen@vigg.ru 6 Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, Москва, 115478; факс: +7(499)324-6352, электронная почта: biochimia@mtu-net.ru

Поступила в редакцию 30.11.14 После доработки 19.01.14

Метилирование CpG-островков промоторных районов и взаимодействие микроРНК с матричными РНК генов-мишеней относятся к совокупности многоуровневых механизмов регуляции экспрессии генов. Цель настоящей работы — оценить возможность опосредованного влияния метилирования генов микроРНК на активацию их генов-мишеней в опухолях легкого. С использованием единой коллекции образцов немел-коклеточного рака легкого показано, что повышение уровня мРНК генов RHOA и NKIRAS1 статистически значимо (P < 10-11, по Спирману) ассоциировано как с потерей метилирования их CpG-островков, так и с метилированием ряда генов микроРНК, предсказанных как регуляторные по данным miRWalk. Определены новые потенциальные регуляторные микроРНК для RHOA (miR-9-1/-3, -34b/c, -129-2, -125b-1, -375, -1258) и NKIRAS1 (miR-34b/c, -129-2, -125b-1, -193a, -124a-1/-2/-3, -212, -132) при раке легкого.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: CpG-островки, метилирование, микроРНК, гены-мишени, RHOA, NKIRAS1, мРНК, рак легкого.

Рак легкого стоит на первом месте по частоте заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей. Ежегодно в мире заболевает около 1,3 млн и умирает 1,2 млн человек. В Рос-

сии от рака легкого ежегодно умирают более 40 000 человек [1]. Пятилетняя выживаемость при обнаружении рака легкого на первой-второй стадии составляет 57—67%, на третьей — 5—25%

Принятые сокращения: миРНК — микроРНК; МС-ПЦР — метилспецифичная ПЦР; НМРЛ — немелкоклеточный рак легкого; МЧРА — метил-чувствительный рестриктазный анализ; ОТ-ПЦР — (здесь) ПЦР на кДНК, полученной с помощью обратной транскрипции РНК.

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-325, 22.02.2015.

** Адресат для корреспонденции.

и четвертой — менее 1%. Причем, к наиболее распространенному виду рака легкого (более 90%) относится немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ). Эти данные показывают актуальность изучения механизмов регуляции генов в патогенезе НМРЛ, что важно для выявления новых молекулярных маркеров и мишеней таргетной терапии столь социально значимого заболевания.

Регуляция экспрессии генов осуществляется на различных уровнях и ее механизмы разнообразны [2, 3]. Эпигенетические механизмы в комплексе с генетическими (мутациями генов и хромосомными аберрациями) ответственны за регуляцию активности генов и сигнальных путей клетки. К совокупности эпигенетических механизмов относятся метилирование промо-торных СрО-островков генов, кодирующих белки, и воздействие регуляторных миРНК, связывающихся с З'-нетранслируемым участком матричной РНК гена-мишени. Метилирование промоторных СрО-островков может вызывать инактивацию гена на геномном уровне, а взаимодействие регуляторных миРНК с мРНК осуществляется на посттранскрипционном уровне и приводит к разрушению мРНК и нарушению трансляции. Этот путь инактивации белок-ко-дирующего гена находится в зависимости от содержания данной миРНК, синтез которой может быть подавлен с помощью ряда механизмов, включая метилирование промоторного СрО-островка гена данной миРНК. За последнее десятилетие резко возрос интерес к определению мишеней метилирования, метилом и мишеней миРНК в опухолях разных локализаций [4—7].

Важное свойство миРНК — ее широкая муль-титаргетность. Каждая миРНК может участвовать в регуляции сотни белок-кодирующих генов, и наоборот, структурный ген обычно представляет мишень для набора миРНК (например, т1КМ&1к: [8]). Согласно данным биоинформатики, миРНК потенциально вовлечены в регуляцию более половины белок-кодирующих генов. В опухолях миРНК может выполнять и онко-генные функции (miR-21), подавляя гены-суп-рессоры опухолевого роста, и супрессорные функции (miR-34), подавляя онкогены и гены прогрессии опухолей [7]. Противоопухолевые супрессорные миРНК могут инактивироваться метилированием во многих видах рака, что способствует активации онкогенов, относящихся к их мишеням. Данная работа нацелена расширить круг супрессорных миРНК и их генов-мишеней. В качестве таких мишеней были исследованы два гена короткого плеча хромосомы 3 человека (Зр) RHOA (3р21.31) и NKIRAS1 (Зр24.2) при НМРЛ.

Известно, что среди прочих геномных районов 3р-плечо представляет область экстремально частых делеций в эпителиальных опухолях легкого, почки и других тканей. С участием авторов идентифицированы критичные районы 3p, содержащие множество генов-супрессоров опухолевого роста; к наиболее изученным онкосуп-рессорам 3p относятся RASSF1A, RARB2, SEMA3B, CTDSPL и др. [9, 10]

Однако в опухолях на 3p детектированы не только делеции, но и амплификации, и, соответственно, гены, проявляющие повышенную экспрессию и онкогенную активность. Например, в районе MECA3 (Major Epithelial CAncer region 3, 3p21.31) потеря одного аллеля наблюдается часто в комбинации с амплификацией второго аллеля [11—13]. И действительно, в этом районе идентифицировано несколько генов, проявляющих функции онкогенов, например, протоонкогены MST1R/RON и RHOA. Так, из двух альтернативных транскриптов MST1R/RON (функционального и онкогенного) в опухолевых клетках активируется онкогенный транскрипт [14].

Онкогенный потенциал и повышенная экспрессия RHOA отмечена в эпителиальных опухолях разных локализаций, причем как на уровне белкового продукта, так и мРНК [15—17]. Показано, что мутации в гене RHOA в эпителиальных опухолях не обнаруживаются и, следовательно, существуют некие другие факторы, повышающие его экспрессию в онкогенезе. Для гена NKIRAS1 (из района 3р24.2) (гомолога онкогена ras), продукт которого регулирует активность транскрипционного фактора NF-kappaB [18, 19], нами получены первые данные о повышенной транскрипционной активности в опухолях молочной железы и легкого, которые также позволяют предполагать онкогенную функцию NKIRAS1 в этих видах рака [20, 21].

В представленной работе исследована роль метилирования в регуляции экспрессии прото-онкогенов RHOA (3p21.31) и NKIRAS1 (3р24.2) при НМРЛ, а именно метилирования CpG-ост-ровков их собственных промоторных районов и CpG-островков ряда генов миРНК, предсказанных как регуляторные (по данным miRWalk [8]).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выбор генов миРНК, перекрывающихся с СрО-островками и связанных с развитием опухолей, а также предсказанных как регуляторные для генов RHOA (3р21.31) и NKIRAS1 (Зр24.2), проводили с привлечением базы данных miRWalk [8].

Образцы опухолей и гистологически неизмененной ткани легкого собраны и клинически оха-

рактеризованы в ФГБНУ РОНЦ от 35 больных, находившихся там на обследовании и лечении. В исследование включены больные НМРЛ, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию. Опухоли классифицированы в соответствии с TNM-классификацией Международного противоракового союза и описаны гистологически на основании классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) [22, 23]. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (толщина 3—5 мкм), окрашенных эозином и гематоксилином. Отбирали образцы с содержанием опухолевых клеток не менее 70%. Образцы тканей хранили при —70°.

Высокомолекулярную ДНК выделяли из образцов опухоли и неизмененной ткани легкого по стандартной методике, включающей обработку клеток протеиназой К при 37° в течение ночи, последующую экстракцию смесью фенола и хлороформа и осаждение этанолом. ДНК хранили при —20°. Качество и концентрацию ДНК проверяли с помощью электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле с использованием ДНК фага-А («Fermentas», «Thermo Fisher Scientific», США) в качестве эталона сравнения.

Суммарную РНК выделяли из образцов опухоли и гистологически неизмененной ткани с помощью экстракции смесью гуанидинизотио-цианат-фенол-хлороформ [24]. Образцы РНК перед применением в исследованиях проходили обработку ДНКазой, свободной от РНКазы. Водный раствор РНК хранили при температуре -40°.

кДНК синтезировали на матрице суммарной РНК с использованием обратной транскрипта-зы вируса лейкоза мышей Молони (M-MuLV Reverse Transcriptase, «Fermentas», «Thermo Fisher Scientific», США) и вырожденных гепта-меров (random heptamers) в качестве праймеров по протоколу, предлагаемому фирмой.

Содержание мРНК RHOA и NKIRAS1 определяли методом полуколичественной ОТ-ПЦР в парных образцах от 35 больных НМРЛ. Прайме-ры, температура отжига (Тотж) и размеры продуктов ПЦР приведены в таблице. ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Tris-HCl, рН 8,8, 16,7 мМ (NH4)2SO4, 0,01%-ный Tween-20, по 0,2 мМ каждого dNTP, по 0,2 мкМ каждого праймера, 2 мкл кДНК и 1 ед рекомбинантной термостабильной Taq ДНК-по-лимеразы («Fermentas», «Thermo Fisher Scientific», США). Реакцию амплификации проводили по программе: 95°, 5 мин; 35 циклов (94°, 15 с, Тотж. (таблица) 25 с, 7

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»