БИОХИМИЯ, 2003, том 68, вып. 1, с. 145 - 153
УДК 577.122.3
АКТИВАЦИЯ ГУАН0ЗИН-5'-3-0-(ТИ0)ТРИФ0СФАТ0М ИНДУЦИРУЕТ ДЕЗАГРЕГАЦИЮ а-СУБЪЕДИНИЦЫ G0-БЕЛКА
© 2003 г. Л. Жанг, Ш. Янг, Ю. Хуанг*
National Laboratory of Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; fax: 0086-010-64872026, E-mail: huang@sun5.ibp.ac.cn
Поступила в редакцию 16.03.02 После доработки 25.04.02
Миристилированную а-субъединицу G-белка (G„a) экспрессировали в штамме JM109 клеток Escherichia coli, котрансформированном плазмидами pQE60 (GDa) и pBB131 (N-миристоилтрансфераза, NMT). По данным гель-электрофореза в неденатурирующих условиях и гель-фильтрации, высокоочищенная G„a в связанном с GDP состоянии может образовывать ди-, три-, тетра-, пента- и гексамерные олигомеры. Активация гуанозин-5'-3-0-(тио)трифосфатом (GTPyS) индуцирует дезагрегацию олигомерных форм GDa до мономеров. При обработке G„a сшивающим агентом N, №-1,4-фенилендималеимидом (p-PDM) регистрировали образование множественных поперечно-сшитых продуктов, которое не происходило в случае предварительной обработки белка GTPyS. Иммуноблоттинг также выявил факт олигомеризации очищенной GDa и ее дезагрегацию под действием GTPyS. Эти результаты являются прямым подтверждением теории «дезагрегации-сопряжения». Дезагрегирующий эффект GTPyS позволяет установить регуляторную роль обмена GDP на GTP в механизмах сигнальной трансдукции, сопряженных с G-белками.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: G„a, GTPyS, химическое поперечное сшивание, олигомеризация и дезагрегация, обмен GDP/GTP.
Пути преобразования регуляторных сигналов, сопряженных с G-белками, включают рецепторы, сами G-белки (гетеротримерные гуа-ниннуклеотидсвязывающие белки) и эффекторы [1—3]. Стимуляция G-белков активированными рецепторами приводит к изменению активности различных ферментов и ионных каналов. В связанном с GDP состоянии G-белки неактивны, их активация происходит путем опосредованного рецептором обмена гуаниновых нуклеотидов, в результате которого GTP связывается с a-субъединицей (Ga). Связывание GTP ведет к диссоциации Ga ■ GTP от субъединиц GPy и активации последующих эффектор-ных звеньев сигнального пути как под действием Ga ■ GTP, так и свободными GPf-субъедини-цами [3]. Поскольку G-белки не могут свободно диффундировать в мембране, модель «диссоциации субъединиц» не дает удовлетворительного
Принятые сокращения: ВС1Р — 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат, В 8 — бис(сульфосукцинимидил)суберат, ДТТ — дитиотреитол, ОРСЯб — рецепторы, сопряженные с в-белками, вТРу8 — гуанозин-5'-3-0-(тио)трифосфат, 1РТв — изопропилтио-Р-В-галактозид, МВТ — тетразолий нитросиний, ММТ — М-миристоилтрансфераза, р-РБМ — М,№-1,4-фенилендималеимид.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
объяснения тому, как активация рецептора может (теоретически) привести к активации многих Ga и быстрому (за считанные доли секунды) и обратимому преобразованию регуляторного сигнала. Недавно рецепторы, сопряженные с G-белками (GPCRs), пополнили список поверхностных рецепторов клетки, способных к ди-меризации. Димеризация приводит к изменению связывания лиганда, сигнализации и маршрутов дальнейшей передачи сигнала от этих рецепторов [4, 5]. Как показали последние кристаллографические исследования, N-конце-вой «хвост» фосфолипазы C-р, являющийся эффектором Gq, может также опосредовать диме-ризацию [6]. Однако точная структура G-белков в связанном с GDP и GTP состоянии остается невыясненной. Родбелл и соавт. провели серию исследований по солюбилизации Gs-, G^ и Gr белков октилглюкозидом и Gs-, G^, Gr, и Gq-белков дигитонином из синаптосом мозга крысы [7, 8], а также солюбилизации Gsa октилглюкозидом из мембран печени крысы [9]. Как показали эти исследования, в детергентных экстрактах клеточных мембран G-белки представлены мультимерными структурами, которые в процессе активации GTP дезагрегируются на мономеры. Эти результаты легли в основу гипотезы о том, что в связанном с GDP состоянии белки
образуют мультимерные формы, которые дезагрегируют до мономеров при активации GTP. Однако большинство экспериментов лаборатории Родбелла было выполнено на клеточных мембранах с использованием детергентных экстрактов, результаты которых не могут служить прямым доказательством того, что G-бел-ки сами по себе существуют в виде олигомерных структур, а не гетеротримерных мономеров и что активация GTP приводит к дезагрегации олигомеров. Хорошо известно, что в трансмембранной передаче сигнала, сопряженной с G-бел-ками, ключевым событием является обмен GDP на GTP. Поскольку а-субъединица (Ga) выполняет важную каталитическую функцию гетеро-тримерных G-белков, в настоящей работе исследовали олигомеризацию Goa в связанном с GDP состоянии и дезагрегацию олигомеров Goa при связывании GTP (Goa ■ GTP). Объектом исследования послужила Goa из Escherichia coli. Полученные результаты могут способствовать лучшему пониманию роли структур G-белков в трансмембранной передаче регуляторного сигнала и дальнейшему выяснению важной роли обмена GDP/GTP в сигнальной трансдукции, сопряженной с G-белками.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реактивы. В работе использовали Tris, дитио-треитол (ДТТ), тетразолий нитросиний (NBT), 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат ((BCIP), козий антикроличий Ig, конъюгированный с щелочной фосфатазой фирмы «Promega» (США)). Гуанозин-5'-3-0-(тио)трифосфат (GTPyS), Hepes, БСА были приобретены у «Воёпп^ег Mannheim» (Германия), N,N'-1,4-фенилендималеимид (^-PDM), мочевина, уреаза из канавалии мечевидной, куриный яичный альбумин — у «Sigma Aldrich» (США). ß-Меркаптоэтанол получен от фирмы «Merck» (Германия), нитроцеллюлозные мембраны — от «Gelman» (США). Кроличьи поликло-нальные антитела против а-субъединицы Go-белкa приобретены у «Santa Cruz Biotechnology» (США). Плазмида pQE60 (Goa) была любезно предоставлена профессором С. Мамби (University of Texas, Southwestern Medical Center, США), а плазмида рВВ131 — профессором Гордон (University of Washington, США). Колонка для гель-фильтрации Superdex™ 200 HR 10/30 приобретена у «Amersham Pharmacia Biotech Inc.» (Англия).
Экспрессия и очистка миристилированной Goa. Миристилированную Goa получали по методу Мамби [10] с незначительными модификациями. Штамм JM109 клеток E. coli ко-трансформиро-вали плазмидами pQE60 (Goa) и рВВ131 (NMT)
и выращивали в обогащенной среде Т7 (2%-ный триптон, 1%-ный дрожжевой экстракт, 0,5%-ный NaCl, 0,2%-ный глицерин, 50 мМ КН2РО4, рН 7,2) с добавками ампицилина (50 мкг/мл) и канами-цина (50 мкг/мл). Для индукции синтеза NMT и Goa добавляли изопропилтио-р-В-галактозид (IPTG) в конечной концентрации 60 мкМ. Клетки собирали и лизировали лизоцимом; ли-зат центрифугировали 1 ч при 30 000 g. Надоса-дочную жидкость наносили на колонку с DEAE-сефацелем и элюировали 300 мМ NaCl. К полученному элюату добавляли (NH4)2SO4 и GDP (конечные концентрации 1,2 М и 25 мкМ соответственно), после чего его наносили на колонку с фенилсефарозой и элюировали градиентом сульфата аммония (от 1,2 до 0 М). На этом этапе происходило разделение миристилированных и немиристилированных форм Goa. Фракции, содержащие Goa, объединяли, диализовали в течение ночи против буфера Q (50 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 0,02 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ) для удаления сульфата аммония. Препарат белка затем наносили на колонку с Q-сефарозой и элюировали градиентом NaCl (0—300 мМ) в буфере Q. Белковые фракции анализировали Ds-Na-электрофо-резом и те из них, которые содержали высоко-очищенную Goa, объединяли и хранили в жидком азоте.
Связывание GTPyS и неферментативное паль-митирование миристилированной Goa. Связывание [35S]GTPyS проводили по методу Нортупа [11].
Неферментативное пальмитирование мирис-тилированной Goa проводили по методу Дункан [12].
Непрерывный гель-электрофорез в неденатурирую щих условиях проводили, как описано Боллаг и соавт. [13], с незначительными модификациями. Величину рН у всех буферов доводили до 8,0. 20 мкл Goa ■ GDP смешивали с 5 мкл пятикратного буфера для образцов, содержащего 300 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 50%-ный глицерин (по объему), 0,05%-ный бромфеноловый синий (масса/объем). Полученную смесь подвергали электрофорезу в неденатурирующих условиях в градиентном 3-20%-ном геле в течение 5 ч при постоянном напряжении 200 В. Goa ■ GTPyS получали, инкубируя 10 мкМ Goa ■ GDP в 20 мМ Hepes, рН 8,0, содержавшем 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 7,5 мМ MgCl2 и 500 мкМ GTPyS, в течение 20 мин при 30°. 10 мкл Goa ■ GTPyS смешивали с пятикратным буфером для образцов и подвергали электрофорезу (см. выше).
Вестерн-блоттинг проводили как описано Боллаг и соавт. [13]. 20 мкл 2 мкМ Goa ■ GDP или Goa ■ GTPyS разделяли в градиентном 3-20%-ном полиакриламидном геле. Перенесенный на мембраны белок инкубировали с кроличьими
поликлональными антителами против Goa мыши (разведение 1 : 100) при 37° в течение 2 ч и козьим антикроличьим IgG, конъюгированным со щелочной фосфатазой (1 : 7000) в течение 2 ч при той же температуре.
Поперечное сшивание Goa при помощи p-PDM проводили, как описано ранее [14]. Очищенную Goa диализовали в течение 4 ч против буфера А (20 мМ Hepes, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ MgCl2, рН 8,0) для удаления ДТТ. Сшивание 5 мкМ Goa ■ GDP или Goa ■ GTPyS проводили в диметилформа-миде при помощи 75 мкМ p-PDM. После 20-мин инкубации при 20° реакцию останавливали, добавляя 8 мМ р-меркаптоэтанол.
Гель-фильтрация. 100 мкл 5 мкМ Goa вводили в колонку Superdex™ 200 HR 10/30, используя для гель-фильтрации систему ВЭЖХ AKTA purifier («Amersham Pharmacia Biotech»). Элю-цию буфером проводили при скорости потока 0,5 мл/мин, регистрируя выход белков при 280 нм. В параллельных экспериментах в ту же колонку вводили белки-маркеры молекулярной массы, включавшие уреазу из канавалии мечевидной и куриный яичный альбумин.
Концентрацию белка определяли по методу Брeдфорд, используя БСА в качестве стандарта [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Очистка миристилированной рекомбинантной Goa. Клетки E. coli, экспрессирующие Goa, собирали, лизировали и центрифугировали (см. раздел «Методы исследования»). Полученную надосадочную жидкость последовательно наносили на колонки с DEAE-сефац
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.