БИОХИМИЯ, 2003, том 68, вып. 1, с. 66 - 75
УДК 577.152.1
АКТИВАЦИЯ ПЕРОКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОВ 2-АМИНОТИАЗОЛОМ
И МЕЛАМИНОМ
© 2003 г. Е.И. Карасева, И.В. Наумчик, Д.И. Метелица*
Институт биоорганической химии НАН Беларуси, 220141 Минск, ул. Акад. Купревича, 5/2; факс: (375)-(172)63-7274, электронная почта: metelitza@iboch.bas-net.by
Поступила в редакцию 08.11.01 После доработки 04.01.02
Пероксидазное окисление 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ), орто-фенилендиамина (ФДА) и 5-амино-салициловой кислоты (5-АСК) существенно ускоряется в присутствии 2-аминотиазола (АТ) и меламина (МА), с увеличением концентрации которых симбатно возрастают величины кса1 и Кт для ТМБ и ФДА. В качестве количественной характеристики активации пероксидазного окисления ТМБ и ФДА использован коэффициент (степень) а (М-1), который существенно зависит от рН в интервале 6,2—6,4 для пары ТМБ—АТ, 6,4—7,4 для ТМБ—МА и 6,0—7,4 для ФДА—МА. Увеличение коэффициента а с ростом рН подтверждает нук-леофильную природу активации пероксидазного окисления ароматических аминов в присутствии АТ и МА. В оптимальных условиях коэффициенты а для пар ТМБ—АТ, ФДА—АТ, ТМБ—МА и ФДА—МА меняются в пределах (1,90—3,53) • 103 М—1.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: пероксидаза хрена, тетраметилбензидин, о-фенилендиамин, 5-аминосалициловая кислота, активация окисления, 2-аминотиазол, меламин, нуклеофильный катализ.
Ароматические амины 3,3',5,5'-тетраметил-бензидин (ТМБ), орто-дианизидин (о-ДА), орто-фенилендиамин (ФДА) и 5-аминосалициловая кислота (5-АСК) широко используются в качестве субстратов пероксидаз (КФ 1.11.1.7) в современных высокочувствительных биоаналитических методах — в иммуноферментном анализе (ИФА) [1], иммуноцитохимии [2], в хемилюми-несцентном анализе, хемилюминесцентном ИФА [3] и биосенсорных устройствах [4]. Одним из способов повышения чувствительности перечисленных методов является активация («усиление») пероксидазного окисления названных выше ароматических аминов. Краткий анализ принципиально различающихся способов активации пероксидазного окисления аминов проведен в нашей предыдущей работе [5]. Исторически первым путем ускорения пероксидазного окисления аминов стало добавление в реакционную среду азотсодержащих органических оснований — аммиака, имидазола и его производ-
Принятые сокращения: А — активатор пероксидаз-ной реакции, АТ — 2-аминотиазол, 5-АСК — 5-аминосали-циловая кислота, МА — меламин (2,4,6-триамино-1,3,5-триазин), поли(АДСТ) — поли(2-аминодисульфидтиазол), ПХ — пероксидаза хрена, ТМБ — 3,3',5,5'-тетраметилбен-зидин, ФДА — орто-фенилендиамин, ФЦБ — фосфат-цит-ратный буфер.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ных, пиридина, которые при рН > 6,5 активируют фермент как нуклеофилы, меняющие рК функциональных групп активного центра пе-роксидаз и расширяющие рН-оптимум их каталитической активности: изучена кинетика пероксидазного окисления о-ДА и пара-фенилен-диамина, активированного пиридином, имида-золом [6, 7] и его многочисленными производными [8—10], а также 1,2,4-триазолом, 4-амино-пиридином и замещенными индолами [11].
Недавно нами показано сильное активирующее влияние поли(5-аминодисульфида салициловой кислоты) на пероксидазное окисление ТМБ [5] и меламина (МА) — на окисление ФДА [12], количественно охарактеризованное коэффициентом (степенью) активации а (М—1), определенным при разных рН среды и означающим увеличение кинетических параметров кса1 и Кт при содержании в реакционных смесях 1 М активатора: в оптимальных условиях процесса коэффициент а для пары ТМБ—поли(5-амино-дисульфидсалициловая кислота) при рН 7,0 равен 2,44 • 105 М—1 [5], а для пары ФДА—меламин при рН 7,4 составляет 2,41 • 103 М—1 [12].
Анализ активации пероксидазного окисления ароматических аминов органическими основаниями [5] показал, что механизм этого процесса до конца не ясен. По этой причине остается актуальным систематическое исследование активации пероксидазного окисления разных
ароматических аминов одним и тем же органическим основанием, с одной стороны, и активации окисления одного и того же амина разными активаторами, с другой.
Цель настоящей работы — сравнительное кинетическое изучение активации пероксидаз-ного окисления ТМБ, ФДА и 5-АСК 2-амино-тиазолом (АТ) и активация окисления ТМБ и 5-АСК меламином (МА) и сопоставление полученных количественных данных. Выбор субстратов пероксидазы (ТМБ, ФДА и 5-АСК) определяется их практической значимостью [1—4] и структурными различиями. Выбор 2-аминотиа-зола в качестве одного из активаторов обусловлен наличием у него свойств ароматических аминов и ярко выраженной нуклеофильности при рН > 6, а также легкостью электрофильного замещения в положение 5; выбор меламина (2,4,6-триамино-1,3,5-триазина) обусловлен сильной зависимостью его нуклеофильности от рН, симметричностью молекулы и ранее установленным нами эффективным активирующим влиянием этого соединения на пероксидазное окисление ФДА [12].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реагенты. В работе использовали кислую изо-форму пероксидазы хрена (ПХ, КФ 1.11.1.7) марки Ас оптическим показателем чистоты RZ 2,25 или 2,40 (НПО «Биолар», Олайне, Латвия). Концентрацию фермента определяли спектро-фотометрически, используя молярный коэффициент поглощения (в) в максимуме полосы Соре (403 нм), равный 102 000 М-1 ■ см-1 [13]. В качестве окислителя применяли разбавленный пергидроль, определяя концентрацию Н2О2 спект-рофотометрически с использованием в230, равного 72,1 М-1 ■ см-1 [14]. В качестве восстанавливающих субстратов ПХ применяли ТМБ («Serva», Германия), ФДА марки х.ч. (Харьковский химико-фармацевтический завод, Украина), который очищали возгонкой в вакууме, и 5-АСК («Реахим», Россия), УФ-спектр которой в 10%-ном ДМСО характеризовался максимумами поглощения при 240 и 300 нм и соответствующими молярными коэффициентами поглощения в, равными 3310 и 3470 М-1 ■ см-1.
В качестве эффекторов пероксидазного окисления ароматических аминов использовали 2-ами-нотиазол (АТ) и меламин (МА) («Реахим», Россия). МА марки х.ч. в УФ-спектрах поглощения имел максимумы при 212 нм в дистиллированной воде и при 223 нм в 0,015 М фосфат-цитрат-ном буфере (ФЦБ), рН 6,0. Использовали также поли(2-аминодисульфидтиазол) (поли(АДСТ)) со
средней молекулярной массой ~1850 Да, который был синтезирован по описанной ранее методике [15] и любезно предоставлен нам Ю.П. Лосевым (Химический факультет Б ГУ, Минск). Максимуму поглощения поли(АДСТ) в ДМСО (при 267 нм) соответствует в, равный 57 400 М-1 • см-1, из сопоставления которого с величиной в254 (7000 М-1 • см-1) для АТ следует, что поли(АДСТ) содержит почти восемь мономерных звеньев.
Органические растворители диметилформа-мид (ДМФ) и диметилсульфоксид (ДМСО) перед употреблением перегоняли. Исходные растворы фосфатного и фосфат-цитратного буферов, Н2О2, ПХ и ФДА готовили в дистиллированной воде, растворы ТМБ, 5-АСК, 2-амино-тиазола - в ДМФ, а раствор поли (АД СТ) - в ДМСО. Конечные концентрации реагентов в разных сериях экспериментов указаны в подписях к рисункам и таблицам и в тексте статьи.
Пероксидазное окисление ТМБ, ФДА, 5-АСК, а также пар ТМБ-АТ, ТМБ-МА, ТМБ-по-ли(АДСТ), ФДА-АТ, ФДА-поли(АДСТ), 5-АСК-АТ и 5-АСК-МА проводили при 20° на спектрофотометре Specol-211 («Carl Zeiss», Германия), имеющем термостатируемое кюветное отделение.
Пероксидазное окисление ТМБ и пар ТМБ—АТ, ТМБ-поли(АДСТ) и ТМБ-МА. Для приготовления реакционной смеси общим объемом 1 мл в пробирку вносили 0,7 мл дистиллированной воды, 0,1 мл 0,1 М фосфатного буфера, 0,05 мл раствора ТМБ (0,02 М) в ДМФ, 0,05 мл ДМФ в опытах с добавлением АТ или 0,05 мл ДМСО в опытах с поли(АДСТ), 0,05 мл ПХ (20 нМ) и 0,05 мл Н2О2 (0,02 М). Перед добавлением Н2О2 смесь выдерживали 3 мин при 20°. В типичном эксперименте при окислении ТМБ и пар ТМБ-АТ, ТМБ-поли(ДДСТ) в 0,01 М фосфатном буфере с заданным рН, содержавшем 10%-ный ДМФ или 5%-ный ДМФ и 5%-ный ДМСО, конечные концентрации реагентов составляли 1 нМ (ПХ), 1 мМ (ТМБ и Н2О2). Концентрации эффекторов разные.
При окислении пары ТМБ-МА реакционная смесь общим объемом 1 мл содержала в 0,015 М ФЦБ с заданным рН 0,4 нМ ПХ, 1 мМ ТМБ, 1 мМ Н2О2, 5%-ный ДМФ и заданные концентрации меламина. В этом случае реакцию начинали добавлением раствора ПХ.
Реакции пероксидазного окисления ТМБ в присутствии активаторов и без них вели 1-2 мин, регистрируя поглощение продукта окисления ТМБ в его максимуме при 655 нм (^655) и рассчитывая начальную скорость реакции (v0) с использованием молярного коэффициента поглощения в 39 000 М-1 • см-1 [13].
Пероксидазное окисление ФДА и пар ФДА—АТ, ФДА-поли(АДСТ). Для приготовления реакци-
онной смеси общим объемом 1 мл в пробирку вносили 0,7 мл Н2О, 0,1 мл 0,15 М ФЦБ, 0,05 мл ФДА (0,04 М), 0,05 мл ПХ (20 нМ), 0,05 мл ДМФ в опытах с АТ и 0,05 мл Н2О2 (0,04 М), перед добавлением которой смесь выдерживали 3 мин при 20°. В типичном эксперименте конечные концентрации реагентов в 0,015 М ФЦБ составляли 5% (ДМФ), 1 нМ (ПХ), 2 мМ (ФДА и Н2О2), концентрации 2-аминотиазола были заданы. Реакцию вели 1—2 мин и следили за ней по росту полосы поглощения продукта окисления ФДА (А455), используя для расчета начальной скорости молярный коэффициент поглощения продукта, при рН 6,4 равный 16 400 М1 • см1 [16].
Пероксидазное окисление 5-АСК и пар 5-АСК— АТ, 5-АСК—МА. Для приготовления реакционной смеси общим объемом 1 мл в пробирку вносили 0,7 мл Н2О, 0,1 мл 0,15 М ФЦБ, рН 6,4, 0,05 мл 5-АСК (0,04 М) в ДМФ, 0,05 ДМСО и 0,05 мл ПХ (20 нМ); перед добавлением 0,05 мл Н2О2 (0,04 М) смеси выдерживали 3 мин при 20° и считали это началом реакции. Конечные концентрации реагентов в 0,015 М ФЦБ составляли 5% (ДМФ и ДМСО), 1 нМ (ПХ), 1 мМ (Н2О2) и 2,5 мМ (5-АСК), концентрации АТ разные.
При пероксидазном окислении пары 5-АСК— МА реакционная смесь общим объемом 1 мл содержала в 0,015 М ФЦБ 1 нМ ПХ, 2 мМ 5-АСК, 2 мМ Н2О2, 0,6 мМ МА и 5%-ный ДМФ. В этом случае реакцию начинали добавлением раствора ПХ. Через 1—2 мин регистрировали спектрофо-тометрически рост поглощения продукта реакции (^455), используя для расчета начальных скоростей окисления
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.