БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 5, с. 854-861
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК 577.3
АКТИВАЦИЯ cGMP-СПЕЦИФИЧНОЙ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ ПАЛОЧЕК СЕТЧАТКИ БЫКА КОМПЛЕКСОМ ТРАН СДУЦИН-GTP В ДИАПАЗОНЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ КОНЦЕНТРАЦИИ Са2*
© 2014 г. О.В. Петрухин, Т.Г. Орлова, А.Р. Незвецкий, Н.Я. Орлов
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 149290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3 E-mail: petrukhinoleg@rambler.ru Поступила в p едакцию 09.06.11 г.
Методом рН -метрии в препаратах светоадаптированных наружных сегментов палочек сетчатки быка исследовано кинетическое поведение фосфодиэстеразы, активированной низкими концентрациями GTP (1-2 мкМ) при высоких и низких концентрациях свободных ионов кальция (= 100 мкМ и < 10 нМ соответственно). Полученные результаты согласуются с точкой зрения, в соответствии с которой время жизни активного состояния трансдуцина определяется не только функционированием известной системы RGS-белков, ускоряющих скорость гидролиза GTP в активном центре его а-субъединицы, но и до известной степени зависит и от концентрации свободных ионов Са2+. П редполагается, что Са2+-зависимой инактивации подвергается популяция «свободного» трансдуцина, т.е. белка, который активировался при взаимодействии с родопсином, но не успел вступить во взаимодействие с cGMP-cпецифичной фосфодиэстеразой за время, определяемое длительностью р азвития ответа фоторецепто ра.
Ключевые слова: наружные сегменты палочек сетчатки, система фототрансдукции, сОЫР-специфичная фосфодиэстераза, G-белки, трансдуцин, регуляция ионами Ca2+.
О сновными элементами молекулярного усилителя наружных сегментов палочек (Н СП) сетчатки позвоночных являются рецепто р света мембранный белок родопсин, гетеротример ный вТР-связывающий белок трансдуцин и исполнительный фермент свМР-специфичная фосфодиэстер аза (РБЕ) [1,2]. Поглотившая квант света молекула родопсина за время ее жизни в активном состоянии (г = 1 с) последовательно взаимодействует с большим числом (102-103) молекул трансдуцина, индуцируя их переход из неактивного состояния трансдуцин-вБР в активное состояние трансдуцин-вТР [3,4]. Такой процесс ведет к активации значительного количества (102-103) молекул РБЕ и, как следствие, к гидролизу вторичного мессенджера свМР [3,4]. Падение концентрации свМР инактивирует свМР-регулируемые ион-
Сокращения: Н СП - наружные сегменты палочек сетчатки, PDE - cGMP-cпецифичная фосфодиэстераза (PDE6), [Са]- - концентрация свободных ионов Са2+, RGS-бел-ки - белки-регуляторы процессов, происходящих при участии G-белков (Regulators of G^ratem Signaling), PDEy -ингибиторная у-субъединица PDE, GTP[S] - гуанозин-5'-[у-тио]трифосфат, негидролизуемый аналог GTP, к.м.м. -кажущаяся молекулярная масса.
ные каналы плазматической мембраны НСП [5] и в конечном итоге приводит к генерации электрического ответа фоторецептора.
Ответ фоторецептора на квант носит кратковременный характер. Поэтому вслед за этапом активации следуют процессы выключения каждого из элементов каскада и восстановление концентрации свМР до первоначального ур ов-ня (до уровня, характерного для темноадапти-рованного фоторецептора). Ключевую роль в этих процессах играет кальций.
В темноадаптир ованных Н С П относительно высокая (=100 нМ) внутриклеточная концентрация свободных ионов Са2+ ([Са2+];) поддерживается благодаря его входу чер ез свМР-р е-гулируемые каналы [6,7] и его откачке системой Ка+/Са2+,К+-обмена [8-10], локализованной в плазматической мембране. Инактивация свМР-регулируемых каналов в ответ на свет подавляет вход ионов Са2+, тогда как система Ка+/Са2+,К+-обмена продолжает работу. Это проводит к быстрому (100-200 мс) падению концентрации [Са2+] в НСП до наномолярных значений [10-12].
Падение концентрации свободных ионов Са2+ активирует (1) родопсинкиназу, многократно фосфорилирующую фотоактивирован-
ный родопсин и, тем самым, блокир ующую его способность активир овать тр ансдуцин и (2) гуа-нилатциклазу, восстанавливающую концентрацию медиатора свМР до уровня, хар актерного для темноадаптированного состояния фоторецептора (см. обзоры [13-15]). Таким образом, изменение концентрации свободных ионов Ca2+ в цитоплазме Н C П имеет принципиально важное функциональное значение.
Трансдуцин, как и другие GTP-связывающие белки, инактивируется в результате гидролиза GTP до GDP в его активном центр е. В изолированном белке этот процесс протекает намного медленнее (15-20 с) [16]), чем длительность ответа фоторецептора на квант света (1-3 с) (см., например, [17]). Однако в результате многолетних исследований было показано, что в фоторецепторе присутствует довольно сложная система белков-р егулято ров (RGS-бел-ки), состоящая из комплекса белков RGS9-1/G P5L [18-21], якорного белка R9AP, локализующего этот комплекс на поверхности мембран дисков и ингибитор ной у-субъединицы PDE (PDEy) (см., например, [22-24]). Все эти белки участвуют в процессах, ускоряющих гидролиз гуанозинтрифосфата в активном центре а-субъединицы трансдуцина и, соответственно, ее инактивацию.
В фоторецепто ре RGS-система функционирует удивительно изящно - инактивации подвергаются лишь те молекулы активированного трансдуцина, которые достигли PDE и образовали комплекс с ее ингибиторной у-субъеди-ницей [22,23]. Такой комплекс и служит мишенью для действия системы RGS-белков, тогда как активированный трансдуцин, находящийся в процессе поиска PDE, нечувствителен к действию инактиваторной системы [22,23]. Таким образом, инактивации подвергаются лишь те молекулы трансдуцина, которые выполнили свою функциональную роль, а именно активировали PDE.
Все это создавало впечатление, что столь важный процесс, как время жизни активного состояния трансдуцина, которое определяет как коэффициент усиления системы фототрансдук-ции, так и длительность ответа фоторецептора на одиночные кванты света, находится под контролем системы RGS-белков и не зависит от функциональных изменений концентр ации свободных ионов Ca2+ в цитоплазме НСП. Дополнительным аргументом в пользу такой точки зрения являются данные о том, что в колбочках, длительность ответов которых значительно меньше, чем в палочках, концентрация белков RGS-системы значительно выше, чем в
палочках [25]. Это подтверждает нашу точку зрения, согласно котор ой принципиальным различием систем фототрансдукции этих двух типов фоторецепто ров является различная «мощность» их систем инактивации [26].
В настоящей р аботе мы исследовали кинетическое поведение трансдуцин-активирован-ной PDE в Н C П сетчатки быка пр и пр и высоких и низких концентр ациях свободных ионов Са2+ (~ 100 мкМ и < 10 нМ соответственно). Исследование проводили на полностью обесцвеченных Н СП, использование которых в отсутствие экзогенного АТР позволяло сохранить активирующую способность фотоактивированного родопсина в течение длительного времени. Трансдуцин активировали GTP, добавляемым в среду в концентрациях меньших, чем концентрация трансдуцина, т.е. при функционировании трансдуцина в так называемом «однообо-ротном» р ежиме [16,27]. В этом режиме активность PDE отражает концентрацию активных молекул трансдуцина и, таким образом, в известной мере отражает кинетику его инактивации в результате гидролиза связанного GTP до GDP. Возможность такого подхода была впер вые продемонстрирована Ии и Либманом [28], исследовавших кинетическое поведение PDE при ее активации субмикромолярными концентрациями GTP в препаратах НСП сетчатки позвоночных (см. рис. 7 в работе [28]). Pезультаты, полученные в ходе настоящей работы, согласуются с точкой зр ения, в соответствии с которой время жизни активного со -стояния трансдуцина зависит не только от функционирования RGS-системы, но до известной степени опр еделяется и концентр ацией свободных ионов Са2+.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проводили на препаратах НСП сетчатки быка, полученных по методу, близкому к описанному ранее [26,27]. Метод характеризуется использованием одной и той же среды (раствор 40% (w/v) сахарозы, приготовленный на изотоническом буфере (25 мМ HEPES-NaOH, рН 8,0, 140 мМ Nad, 3,5 мМ КС1, 2 мМ Mgd2, 0,5 мМ СаС12)) на всех этапах выделения (гомогенизация сетчаток и последующая очистка НСП в результате двукратной флотации при 100000 g в течение 60 мин без промежуточных промывок изотоническим буфером). Метод позволяет в известной степени со хр анять интактность плазматической мембраны НСП и, тем самым, предотвратить потерю водорастворимых белков. Очищенные НСП (А280/500 = 3,0-3,2) суспендировали в том
же растворе сахарозы в конечной концентрации по родопсину 5-10 мг/мл и хранили в темноте при -20°C в 0,5 мл пластиковых контейнерах. П ринято считать, что молярные концентрации родопсина, трансдуцина и PDE в таких препа -ратах относятся друг к другу как 100:10:1 (см., например, [13]).
Активность PDE в пр епаратах Н СП измеряли рН-метрическим методом [28,29], регистрируя закисление среды, обусловленное появлением протонов в ходе реакции гидролиза субстрата (10 мМ сАМ P или 2 мМ свМР). Начальное значение рН со ставляло 8,0, конечное значение было не ниже 7,8. В данном диапазоне изменение рН являлось практически линейной функцией количества протонов, появившихся в результате реакции. Количество появившихся протонов определяли при титровании системы 100 мМ NaOH.
Кинетику изменений рН регистрировали с помощью малогабаритного (диаметр 3 мм) ком-бинир ованного рН -электрода Е5259 (Sigma-Al-ёпсЬ, США) и высокочувствительного компь-терного рН -метра CPX-2.1 (ИБП РАН, Пущино, Россия), снабженного специально разработанным для данной задачи программным обеспечением. Использованный измерительный комплекс обладал чувствительностью около 0,001 рН при временном р азр ешении около 1 с. P е-акцию вели в термостабилизированных пластиковых кюветах объемом 0,25-0,5 мл при 30°С в среде, содержащей 50 мМ HEPES-NaOH, рН 8,0, 100 мМ NaCl, 30 мМ MgCl2 и 0,1 мМ С а02. Низкую концентрацию свободных ионов Cа2+ (< 10 нМ) обеспечивали добавлением в реакционную среду этиленгликоль тетрауксус-ной кислоты (EGTA) до конечной концентрации 2-5 мМ. Значения [Cа2+] в образца
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.