МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 2, с. 149-156
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.282.23.042.5
АКТИВАЦИЯ ЦИАНИДРЕЗИСТЕНТНОЙ ОКСИДАЗЫ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA ЫРОЬУПСА АДЕНОЗИН 5'-МОНОФОСФАТОМ
© 2004 г. А. Г. Меденцев1, А. Ю. Аринбасарова, Н. М. Смирнова, В. К. Акименко
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 16.01.03 г.
Изучено влияние различных нуклеотидов на активность цианидрезистентной оксидазы в митохондриях и субмитохондриальных частицах дрожжей Yarrowia Иро1уйса. Установлено, что цианидрези-стентное дыхание интактных митохондрии дрожжей К Ыро1уНса не активировалось 5'-АМФ. Инкубация митохондрий при 25°С в течение 3-5 ч, а также обработка митохондрий ультразвуком, фос-фолилипазой А и детергентами приводили к инактивации цианидрезистентной оксидазы. Добавление к митохондриям 5'-АМФ реактивирует цианидрезистентное дыхание. Активирующее действие АМФ усиливается в присутствии азолектина. Среди других нуклеотидов способность к активации альтернативной оксидазы убывала в следующей последовательности: АМФ = ГМФ > ГДФ > > ГТФ > КМФ > ИМФ. Другие нуклеотиды не проявляли активирующего действия. Кажущаяся Кт для АМФ при активации альтернативной оксидазы митохондрий, обработанных тритоном Х-100, составила 12.5 мкМ. Для митохондрий, инкубированных при 25°С, и СМЧ Кт оказалась равной соответственно 20 и 15 мкМ. Измерение содержания адениновых нуклеотидов в клетках дрожжей в процессе развития альтернативной оксидазы показало снижение уровня АТФ, АДФ, АМФ и падение активности дыхания. Добавление к клеткам цианида сопровождалось активацией дыхания, снижением уровня АТФ (в 3 раза) и увеличением АМФ (в 5 раз). Сопряженность процессов усиления дыхания клеток и увеличения уровня АМФ позволяет сделать вывод о том, что стимуляция дыхания цианидом обусловлена активацией альтернативной оксидазы АМФ.
Ключевые слова: дрожжи, митохондрии, цианидрезистентная альтернативная оксидаза, регуляция, активация нуклеотидами.
Резистентное к цианиду дыхание обнаружено у высших растений, грибов, дрожжей и простейших [1]. Цианидрезистентное дыхание обусловлено функционированием в митохондриях не чувствительной к цианиду так называемой "альтернативной оксидазы", которая катализирует перенос электронов от восстановленного убихинона (ко-энзима Q) на кислород в обход основной, цито-хромной дыхательной цепи [1].
Альтернативная оксидаза, локализованная на внутренней мембране митохондрий [2], не чувствительна к цианиду, антимицину А, миксотиазолу и СО [1], но специфически ингибируется производными бензгидроксамовой кислоты (БГК) [3].
Альтернативный путь ответвляется от основной дыхательной цепи на уровне убихинона [4]. Катализируемое альтернативной оксидазой окисление субстратов, которые отдают восстановительные эквиваленты на уровне убихинона (а-глицерофосфат, сукцинат, экзогенный НАДН), не сопряжено с запасанием энергии [5]. С другой стороны, при окислении НАД-зависимых субстратов АТФ может синтезироваться в первом
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: medentsev@ibpm.ser-pukhov.su).
пункте сопряжения комплекса I [5]. Продуктом восстановления кислорода цианидрезистентной оксидазой является вода, а не супероксидный радикал или перекись водорода [6]. Сродство цианидре-зистентной оксидазы к кислороду (Кт > 1.0 мкМ) значительно ниже, чем у цитохромоксидазы (Кт < < 0.1 мкМ) [6].
Изучение митохондрий, изолированных из клеток грибов и дрожжей, обладающих цианид-резистентным дыханием, показало, что в некоторых случаях окисление субстратов было относительно высоко чувствительно к цианиду. Исследования [7-9] показали, что альтернативная оксидаза присутствует в митохондриях, но находится в неактивном состоянии. Добавление к митохондриям нуклеотидов АМФ и ГМФ приводило к активации оксидазы [7-9].
Цель настоящей работы, во-первых - изучить способность различных нуклеотидов активировать цианидрезистентную оксидазу в митохондриях и субмитохондриальных частицах дрожжей Yarrowia Пропса; во-вторых, - определить содержание адениновых нуклеотидов в клетках дрожжей в процессе развития цианидрезистент-ного дыхания и его изменение в ответ на действие цианида и БГК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали дрожжи Уатгом>1а Ы-роЬуЫса ВКМ У-155, полученные из ВКМ РАН. Культивирование дрожжей проводили на солевой среде Ридер, содержащей (г/л): 10.0 - глюкозы, 3.0 -(КН4)2804, 0.7 - М§804, 0.4 - Са(Ш3)2, 0.5 - ШС1, 2.0 - КН2Р04, с добавлением 0.2%-ного дрожжевого экстракта ('та&о") и микроэлементов по Бурк-гольдеру. Культивирование осуществляли в колбах объемом 750 мл со 100 мл среды роста (рН 5.5-6.0) при температуре 29°С на качалке 200 об/мин.
Аэробную инкубацию покоящихся клеток для индукции цианидрезистентного дыхания проводили следующим образом. Клетки логарифмической фазы роста, чувствительные к цианиду (90-95%), дважды отмывали от среды роста дистиллированной водой, суспендировали в 10 мМ фосфатном буфере, рН 6.5. Содержание клеток составляло 3.0-3.5 мг сухих клеток/мл. Инкубацию проводили в колбах обьемом 750 мл с 25 мл клеточной суспензии на качалке (200 об/мин) при 29°С.
Препарат митохондрий получали энзиматиче-ским методом из культуры дрожжей стационарной фазы роста. Клетки дрожжей дважды промывали дистиллированной водой и суспендировали в среде, содержащей 0.9 М сахарозы, 20 мМ фосфатный буфер (рН 6.0), 1 мМ ЭДТА и 3% ли-офилизированного желудочного сока виноградной улитки. Суспензию клеток инкубировали в течение 90 мин в колбах объемом 750 мл со 100 мл клеточной суспензии на качалке (200 об/мин) при 29°С. Далее клетки дважды промывали раствором того же состава без улиточного фермента с помощью центрифугирования при 6000 g 20 мин. Отмытые клетки суспендировали в среде "выделения", содержащей 0.5 М маннит, 10 мМ трис-фосфатный буфер (рН 7.2), 0.5 мМ ЭДТА и 0.1% бычьего сывороточного альбумина. Суспензию обрабатывали на гомогенизаторе "Биомикс" (Венгрия) при 14000 об/мин в течение 2 мин. Обработанные клетки центрифугировали дважды при 3000 g в течение 10 мин для удаления неразрушенных клеток и протопластов. Митохондрии осаждали при 7000 g в течение 30 мин. Осадок митохондрий суспендировали в среде выделения до концентрации белка 10 мг/мл и хранили на льду.
Для получение субмитохондриальных частиц (СМЧ) препарат митохондрий разбавляли в 5 раз средой, содержащей 50 мМ трис-фосфатный буфер (рН 7.2) и 0.5 мМ ЭДТА, и "озвучивали" с помощью ультразвукового дезинтегратора М8Б-150 (Англия) сериями (4-5 раз) по 30 с при максимальном уровне кавитационного шума. СМЧ осаждали при 105 000 g в течение 60 мин. Эту же среду использовали для промывания и суспендирования СМЧ.
Скорость потребления кислорода клетками, митохондриями и СМЧ измеряли на полярографе LP-7 (Чехословакия) с помощью закрытого теф-лоновой пленкой платинового электрода типа Кларка. Среда дыхания содержала 0.6 М маннит, 10 мМ mpwc-фосфатный буфер (рН 7.2), 0.5 мМ ЭДТА и 0.1% бычьего сывороточного альбумина. Конечный объем пробы составлял 2 мл, температура измерения 20-22°С. Начальную концентрацию растворенного в среде кислорода принимали равной 250 мкМ.
Для инактивации цианидрезистентной оксида-зы препарат митохондрий инкубировали при 25°С в течение 3-5 ч, инкубировали с фосфолипа-зой А (0.01 Е на 1 мг белка), обрабатывали тритоном Х-100 при различных соотношениях "детергент : белок", от 0.05 до 0.5 (мг : мг).
Суспензию азолектина готовили с помощью стеклянного гомогенизатора Поттера.
Экстракцию адениновых нуклеотидов из клеток дрожжей осуществляли 5%-ной хлорной кислотой. Для этой цели 4.5 мл клеточной суспензии, отобранной непосредственно из колбы, вносили в пробирку, содержащую 0.5 мл 50%-ной хлорной кислоты, тщательно перемешивали и инкубировали в ледяной бане. Экстракт нейтрализовали 5 N КОН при интенсивном перемешивании. Осадок удаляли фильтрованием через бумажный фильтр или центрифугированием. Экстракт хранили при -15°С. АТФ, АДФ, АМФ определяли на флюориметре MPF-4 ("Hitachi", Япония) по флуоресценции НАД(Ф)Н с гексокиназой, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназой, пируваткиназой и мио-киназой [10].
Концентрацию белка митохондрий и субмитохондриальных частиц определяли с биуретовым реактивом. Перед определением пробы растворяли в 1%-ном растворе дезоксихолата натрия, приготовленном на 1 N КОН.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 представлены типичные кривые потребления кислорода митохондриями дрожжей, обладающих цианидрезистентной оксидазой. На рисунке видно (кривая 1), что свежевыделен-ные митохондрии при окислении экзогенного НАДН проявляли фосфорилирующую активность (АДФ/О = 1.7) и высокий дыхательный контроль (Д.К. = 2.3). Окисление экзогенного НАДН не ингибировалось цианидом и не активировалось при добавлении 5'-АМФ (кривая 2).
Ранее нами было показано [11], что инкубация митохондрий при 25°С в течение 3-5 ч приводит к инактивации альтернативной оксидазы. При этом митохондрии утрачивают способность к фо-сфорилированию АДФ. Как видно на рис. 1, кривая 3, после инкубации митохондрий при 25°С,
I НАДН 1 -^ 1 БГК
~ I АДФ
Д.К. = 2.3 P/O = 1.7
170
70
KCN 175
75
I НАДН I KCN
170
АМФ
J
170 \ » БГК
170 '
НАДН
KCN АМФ
азолектин
160
20
50
160
НАДН I KCN
азолектин АМФ
155
СМЧ
НАДН
KCN
АМФ
азолектин БГК 160 Nî I 100 нмоль O2 160 ^
KCN
СМЧ
НАДН
азолектин
АМФ
70
мито
2
0
мито
мито
3
4
6
5
1 мин
Рис. 1. Влияние 5'-ЛМФ и азолектина на активность альтернативной оксидазы митохондрий и субмитохондриальных частиц (СМЧ): 1 и 2 - нативные митохондрии; 3 и 4 - митохондрии после инкубации при 25°С в течение 5 ч; 5 и 6 -СМЧ после озвучивания митохондрий (4 х 30 с). Добавки: НЛДН - 1 мМ, КСК - 1 мМ, БГК - 5 мМ, ЛМФ - 1 мМ. Цифрами на кривых указана активность дыхания, нмоль О2/(мин мг белка).
окисление НАДН становилось чувствительным к цианиду. Добавление к таким митохондриям АМФ приводило к активации цианидрезистент-ного дыхания, поскольку дыхание полностью подавлялось БГК - ингибитором альтернативной оксидазы.
Добавление АМФ не полностью реактивировало цианидрезистентную оксидазу. Эффект АМФ заметно уси
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.