РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2007, том 1(10), № 2, с. 156-162
— ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ —
АКТИВАЦИЯ ЯДРА НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ В КЛИНИЧЕСКИХ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ. ЭФФЕКТЫ ЦИТОКИНОВОЙ И ПЕПТИДНОЙ РЕГУЛЯЦИИ
© 2007 г. И.В. Нестерова*, И.Н. Швыдченко, Е.В. Фомичева,
С.Г. Петренко
ФГУ «Российский центр функциональной хирургической гастроэнтерологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Краснодар, Россия;
*Институт иммунофизиологии, Москва, Россия
Поступила: 23.03.07 г. Принята: 24.04.07 г.
Целью данного исследования являлось экспериментальное изучение структурных характеристик ядерного хроматина нейтрофильных гранулоцитов (НГ) периферической крови здоровых людей в условиях экспозиции клеток к липополисахариду (ЛПС), с оценкой возможности цитокиновой (ИЛ-1Р) и пептидной — глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП) и бестим (БС) регуляции ЛПС-индуцированной активации ядер нейтрофилов, а также определение особенностей ядерной активации НГ у пациентов с острым деструктивным панкреатитом (ОДП). Активность хроматина ядер НГ тестировали методом поляризационной микроскопии. Установлено дозозависимое реагирование ядерного хроматина НГ на стимуляцию ЛПС. ИЛ-ф обладает дополнительным усиливающим влиянием на ЛПС-индуцированные активационные процессы в ядре. Выявлена высокая активация хроматина ядер НГ у больных с ОДП в стадии гнойно-септических осложнений, сравнимая с непосредственным воздействием ЛПС на клетку. ГМДП и БС оказывают нормализующее действие на активационные процессы в ядре НГ в ранние сроки после их стимуляции ЛПС in vitro.
Ключевые слова: нейтрофильные гранулоциты, ядро, хроматин, активация, анизотропия, регуляция, острый деструктивный панкреатит
Нейтрофильные гранулоциты (НГ) — важный компонент врожденной иммунной защиты. Вследствие своего преобладающего количества на ранних стадиях острого воспаления, НГ являются идеально приспособленными для влияния на последующую лейкоцитарную миграцию и природу воспалительного процесса. Секретируя хемокины и цитокины, НГ рекрутируют и активируют другие имму-нокомпетентные клетки. Участие НГ в цито-киновой сети может являться конститутивным связующим звеном между врожденным и приобретенным иммунным ответом [30].
Экспериментальной моделью нейтрофиль-ного ответа на инфекцию является экспозиция клеток к растворимому липополисахариду (ЛПС). Растворимый ЛПС, находящийся в циркуляции и в инфицированных очагах, рас-
Адрес: 117513 Москва, Ленинский пр., 123-1-59 E-mail: ishv@rambler.ru
познается рецептором, представляющим собой гетеромерный рецепторный комплекс CD14/TLR4/MD2, с каждой молекулой которого ЛПС связывается непосредственно [12, 25]. Результатом воздействия ЛПС на НГ является не только активация их основных эффек-торных реакций — хемотаксиса, кислородного взрыва, адгезии, фагоцитоза, но и ингиби-рование апоптоза [20, 31]. Кроме того, показано, что в процессе «узнавания» ЛПС нейтро-фильными гранулоцитами запускается генная индукция и белковый синтез [13, 15, 22, 27].
Существующие в настоящее время современные методы исследования экспрессии генов позволяют выявить с высокой точностью не только факт активации или репрессии клеточного генома, но и установить конкретные гены и их продукты, вовлеченные в данный процесс. Однако, эти методы являются достаточно сложными, требуют дорогостоящего оборудования и, к сожалению, малодоступны для широкого применения в клинике.
Метод поляризационной микроскопии, использующий оптический анизотропный эффект для изучения физико-химических свойств ядерного хроматина, позволяет эффективно выявить структурные характеристики ядерного материала на разных этапах функционирования клетки [1, 3, 8, 14]. Впервые этот высокочувствительный и доступный метод был использован нами для выявления активации НГ здоровых лиц в экспериментальных условиях и у больных, страдающих язвенной болезнью [5].
Величина анизотропии отражает структурно-молекулярную упорядоченность хроматина, который является основным носителем генетической информации в клетке. Снижение уровня анизотропии может интерпретироваться как показатель, свидетельствующий о явлениях деспирализации хроматина, сопровождающихся ослаблением химических связей комплекса ДНК-гистон в ядрах клеток. Подобные явления указывают на биологическую активацию хроматина, что является предпосылкой для появления матричной активности ДНК [9] и, возможно, последующего белкового синтеза.
Целью данного исследования являлось экспериментальное изучение структурных характеристик ядерного хроматина НГ периферической крови здоровых людей в условиях экспозиции клеток к ЛПС, с оценкой возможности цитокиновой и пептидной регуляции ЛПС-индуцированной активации ядер нейтрофилов, а также определение особенностей ядерной активации НГ у пациентов с острым деструктивным панкреатитом (ОДП).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлась венозная кровь 18 условно здоровых добровольцев обоего пола в возрасте от 21 до 55 лет и 13 пациентов с ОДП — панкреонекрозом в фазе развития гнойных осложнений. Диагноз устанавливался на основании клинико-лаборатор-ных проявлений и ультразвукового исследования.
Анизотропный эффект ядер НГ определяли в мазках цельной крови — контроль 1 (К1) и препарате-капле нейтрофильной взвеси — контроль 2 (К2). НГ выделяли из периферической крови, стабилизированной ЭДТА (2,7%) с помощью центрифугирования на двойном градиенте плотности фиколла-верографина
(1,077:1,093) [11]. Оценивали морфологически чистоту клеточной взвеси (97 — 98%) и жизнеспособность клеток в тесте с трипановым синим (>96%). В концентрации 106 кл/мл НГ инкубировали при 37°С, 1ч с физиологическим раствором (контроль 2) и ЛПС (E. coli: 055:B5, "DIFCO", США) в конечной концентрации 1, 10, 100 и 1000 нг/мл (ЛПС-индуцированная активация). В экспериментах in vitro по изучению возможных иммуномодулирующих влияний цитокиновой и пептидной природы на ядро НГ были использованы рекомбинантный ИЛ-ф - беталейкин (ГНЦ ГосНИИ ОЧБ, Санкт-Петербург), пептид у^-глутаминил^-триптофан — бестим (БС), (ГНЦ ГосНИИ ОЧБ, Санкт-Петербург) в конечной концентрации 1 нг/мл и 0,1 мкг/мл, соответственно, а также глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП, Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва) в конечной концентрации 0,1 и
0.01 мкг/мл. Иммуномодуляторы вносились через 30 мин после добавления в инкубационную среду ЛПС.
После инкубации готовили препарат-каплю на предметном стекле. Мазки высушивали на воздухе, фиксировали смесью этанола и ацетона (1:1) в течение 20 мин, подвергали гидролизу в 5N HCl при температуре 20°С в течение 30 мин, проводили блокаду альдегидных групп раствором гидроксиламина по Р. Лилли [4] при температуре 37°С в течение 3 ч. Мазки окрашивали толуидиновым синим (Merck, Germany) в концентрации 0,05 % на 0,001М цитратном буфере 20 мин (рН5,0), отмывали цитратным буфером, высушивали и исследовали с помощью поляризационного микроскопа «МП8» (объектив ПЛАН АПО МИ 100. 1,25; окуляр К10.) при скрещенном анализаторе и поляризаторе. Для учета интенсивности анизотропного эффекта в НГ использовали модификацию полуколичественного метода Астальди и Вера, адаптированного для изучения ядер [10]. Все ядра были разделены по степени анизотропии на 5 групп, каждой из которых была присвоена определенная величина анизотропии: 0 — полное отсутствие; 4 — анизотропно все ядро (рис. 1). В дальнейшем расчет анизотропии проводился по формуле: СЦИ = (0ха + 1xb + 2xc + 3xd + 4xe)/(a + + b + c + d + e), где СЦИ — средний цитохимический индекс, соответствующий величине анизотропии; a, b, c, d, e — количество клеток с разной величиной анизотропии; 0,
1, 2, 3, 4 — условная степень анизотропии.
it
Рис. 1. Степени анизотропии ядер нейтрофильных гранулоцитов.
А — 4-я степень — максимальный анизотропный эффект (минимальная активность ядерного хроматина); Б — 3-я; В, Г — 2-я; Д — 2 клетки с 1-й степенью; Е — а) контуры клетки с 0-й степенью анизотропии (максимальная активность ядерного хроматина), б) — 2-я степень. Окраска толуидиновым синим при рН 5,0. Ув. об. 100; ок. 10
Статистическая обработка результатов проведена с использованием описательной статистики и критерия Стьюдента. Данные представлены в виде среднего арифметического значения (М) и ошибки средней (±т). Различия считали достоверными при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ результатов топологического исследования ядер НГ периферической крови здоровых людей показал, что величина анизотропии ядерного хроматина составила в среднем 2,45 ± 0,13. Упорядоченность ядерного хроматина свидетельствует о низкой активации ядра «интактных» клеток здоровых лиц.
Экспериментально доказано, что методические манипуляции, связанные с выделением НГ по стандартной методике на градиенте плотности, ведут к активации клеток (усилению экспрессии интегринов, увеличению ок-сидазной активности, изменению чувстви-
тельности к цитокиновым сигналам) [19, 29]. Достоверное снижение уровня анизотропного эффекта ядер НГ в клеточной взвеси (контроль 2) по сравнению с клетками цельной крови (контроль 1) не только подтверждает факт активации НГ в процессе их выделения, но свидетельствует также о вовлечении в этот процесс ядерного хроматина (рис. 2).
С целью более глубокого изучения актива-ционных возможностей ядер НГ нами была предпринята попытка смоделировать условия, способствующие возникновению акти-вационных процессов, приближающихся к естественным. ЛПС (эндотоксин) является основным медиатором активации НГ при грам-отрицательной бактериальной агрессии. Стимуляция клеток различными дозами ЛПС в системе in vitro еще больше снижает структурную упорядоченность хроматина ядер НГ, которая проявляется снижением уровня анизотропии ядер, что свидетельствует о биологической активации хроматина (рис. 2). В наших экспериментах наблюдалось прогрессивное
падение анизотропного эффекта в зависимости от увеличения концентрации ЛПС: минимальный уровень анизотропии, а, соответственно, максимальный уровень активации ядерного хроматина наблюдался при концентрации ЛПС 100 нг/мл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.