МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, том 47, № 3, с. 486-491
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.218
АКТИВИРОВАНИЕ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ JAK/STAT В КУЛЬТУРЕ
КЛЕТОК S2 Drosophila melanogaster
© 2013 г. А. В. Шапошников*, А. С. Крындушкин, Ю. В. Николенко, В. В. Панов, Е. Н. Набирочкина, Л. А. Лебедева, Ю. В. Шидловский
Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, 119334 Поступила в редакцию 26.12.2012 г. Принята к печати 18.01.2013 г.
Сигнальный путь JAK/STAT играет важную роль в различных процессах онтогенеза у высших эукариот. Удобной модельной системой для изучения этого пути является плодовая мушка дрозофила, в которой основные компоненты пути представлены уникальными факторами. В работе описано использование культуры клеток S2 Drosophila melanogaster для изучения активации генов-мишеней указанного пути. Нами показано, что в клетках S2 содержится большое количество белка STAT, который при обработке клеток перванадатом перемещается в ядро. Под действием перванадата белок вместе с другими факторами транскрипции привлекается на регуляторные последовательности генов-мишеней и активирует их транскрипцию.
Ключевые слова: сигнальные пути, JAK/STAT, иммунопреципитация хроматина. культура клеток 82, эукариоты.
ACTIVATION OF JAK/STAT SIGNALING PATHWAY IN S2 Drosophila melanogaster CELL CULTURE, by A. V. Shaposhnikov*, A. S. Kryndushkin, J. V. Nikolenko, V. V. Panov, E. N. Nabirochkina, L. A. Lebedeva, Y. V. Shidlovskii (Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119334 Russia; *e-mail: shaldr23@mail.ru). JAK/STAT signaling pathway plays a critical role in different ontogenesis processes of higher eukaryotes. Fruit fly drosophila is a handy model system used to study this pathway since major components of the pathway are represented by unique factors. This article describes the usage of Drosophila melanogaster S2 cells in studies of the pathway's target genes activation. We showed that S2 cells contain plenty of STAT protein which migrates into nucleus under cells treatment with pervanadate. Then we demonstrated that under per-vanadate action STAT protein along with other transcription factors is recruited onto regulatory sequences of target genes and activates their transcription.
Keywords: signaling pathways, JAK/STAT, chromatin immunoprecipitation, cell culture S2, eukaryotes.
Б01: 10.7868/80026898413030142
У всех многоклеточных животных сигнальный путь 1ЛК/8ТЛТ консервативен и представляет собой относительно простой каскад реакций [1]. Находящиеся на поверхности клетки рецепторы при связывании лиганда димеризуются и активируют ассоциированные с рецептором молекулы 1ЛК-киназы, которые, в свою очередь, автофос-форилируются (что повышает их каталитическую активность), а также фосфорилируют субъединицы рецептора по остаткам тирозина. На конечном
этапе происходит фосфорилирование основной мишени пути — транскрипционных факторов STAT по консервативному остатку тирозина. Фосфорилированные факторы также образуют димеры и транспортируются в ядро, где они запускают транскрипцию генов-мишеней, связываясь со специфическими последовательностями в геноме (рис. 1).
В клетках многих высших эукариот на каждом этапе сигнального пути задействовано целое се-
Принятые сокращения: JAK (Janus Kinase) — семейство ассоциированных с рецепторами киназ; MO (Moira) — фактор, входящий в состав хроматин-ремоделирующего комплекса Brahma; S2 (Schneider 2 cells) — культура клеток Drosophla melanogaster; STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) — активатор транскрипции, участвующий в передаче сигнала; TAF1 (Transcription Activation Factor 1) — субъединица общего фактора транскрипции TFIID; TBP (TATA-Binding Protein) — ТАТА-связывающий белок; субъединица фактора TFIID.TFIID (Transcription Factor II D) — общий фактор транскрипции.
* Эл. почта: shaldr23@mail.ru
мейство факторов. Например, у млекопитающих известно четыре киназы JAK и семь различных молекул STAT, но у некоторых эукариот, например, у дрозофилы, основные участники представлены единичными и уникальными факторами: рецептором является белок Domeless (DOME), JAK-кина-зе соответствует белок Hopscotch (HOP), транскрипционному фактору — STAT92E [3]. Более простая система, характерная для дрозофилы, делает ее более удобным объектом для изучения указанного сигнального пути.
В организме дрозофилы JAK/STAT-путь активируется далеко не во всех клетках-[2], что создает дополнительные сложности в работах, требующих значительного количества биологического материала. Поэтому более целесообразно для исследования этого сигнального пути использовать культуры клеток дрозофилы. Одна из таких культур — эмбриональная линия клеток Schneider (S2), относящаяся к клеткам гемопоэтического ряда [4].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Работа с культурой клеток S2. Клеточную линию Drosophila Schneider cell line 2 (S2) выращивали при температуре 25°C в специальной среде для этих клеток ("Sigma", США), содержащей 10% FBS ("HyClone", США). Для активирования клеток готовили свежий 10мМ раствор перванадата, получаемый при смешении раствора ортованада-та натрия до конечной концентрации 10 мМ и перекиси водорода — до 20 мМ. Раствор перванадата затем обрабатывали каталазой (200 мкг/мл) для удаления избытка перекиси.
Антитела к белкам STAT, TBP [6], TAF1 [6], MOR [7] и РНК-полимеразе II [8] получали при иммунизации кроликов [5]. Антитела к ß-тубули-ну (получены М. Климовски (M Klymkowsky)) и к ламину Dm0 (получены А. Фишером (A. Fisher) приобретены в Developmental Studies Hybridoma Bank (США).
Выделение РНК и количественная ПЦР. Тотальную клеточную РНК выделяли при помощи тризола ("Invitrogen", США) в соответствии с рекомендациями производителя. Для количественной ПЦР использовали ранее опубликованные наборы праймеров [5].
Окрашивание клеток проводили по методике, описанной ранее [6].
Иммунопреципитацию хроматина проводили, как описано ранее [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Содержание фактора STAT в клетках S2
Ранее показано, что гены, кодирующие компоненты пути (гены рецептора dome, киназы hop и
Рис. 1. Схема активации сигнального пути JAK/STAT у дрозофилы [2].
транскрипционного фактора stat), экспрессиру-ются в клетках S2 [10]. Мы подтвердили эти данные, определяя белок STAT в клетках при помощи вестерн-блот анализа (рис. 2). В клеточном лизате детектируется белок STAT, идентичный по подвижности белку STAT тканей эмбрионов дрозофилы. Сравнение содержания STAT, Р-тубули-на и ТАТА-связывающего белка TBP в клеточном лизате S2 и в общем белковом экстракте эмбрионов позволяет сделать вывод, что относительный уровень STAT в клетках очень высок и превышает относительный уровень в общем эмбриональном экстракте, несмотря на то, что именно на стадии
# S2
STAT
бета-тубулин
TBP
Рис. 2. Вестерн-блот-анализ содержания фактора STAT и контрольных белков в общем белковом экстракте эмбрионов дрозофилы и лизате клеток S2.
PV(-) PV(+)
Рис. 3. Вестерн-блот-анализ белка STAT в суммарных лизатах клеткок S2 до обработки перванадатом (PV(-)) и после обработки (PV(+)). Стрелкой показано положение фосфорилированной формы STAT.
развития эмбриона наблюдается один из основных пиков активности гена stat [11].
Фосфорилирование STAT при обработке клеток S2 перванадатом
Транскрипционная активность белка STAT путем его фосфорилирования по остатку тирозина может быть стимулирована перванадатом [12, 13]. Обработка клеток этим реагентом приводит к увеличению доли белка-STAT, фосфорилирован-ного по остатку тирозина [13], причем при низких концентрациях перванадата (50-100 мкМ) увеличения общего уровня фосфорилирования тирозина в клетке не происходит [14]. Вестерн-блот анализ показал, что при обработке клеток перванадатом в концентрации 100 мкМ (2 ч) накапливается белок STAT с меньшей подвижностью (рис. 3), который, по литературным данным [13], соответствует его фосфорилированной форме.
Перенос STAT в ядро при обработке клеток S2 перванадатом
При активации сигнального пути фосфорили-рованная форма STAT направляется в ядро, где запускает транскрипцию соответствующих генов-мишеней. Мы изучили распределение в клетке белка STAT до и после обработки клеток первана-датом (100 мкМ, 2 ч). До обработки белок обнаруживается и в ядре, и в цитоплазме, причем - в сравнимых количествах. Обработка перванадатом приводит к заметному накоплению STAT в ядре, что может свидетельствовать об активировании сигнального пути (рис. 4).
В ядре клеток может быть локализована как фосфорилированная форма STAT (благодаря наличию эндогенной киназной активности HOP в клетках), так и нефосфорилированная форма, выполняющая специфические функции в поддержании структуры гетерохроматина [12]. Для доказательства того, что после обработки перванадатом белок проявляет специфическую транскрипционную активность, требуется измерение уровня экспрессии его генов-мишеней.
Подбор нормировочных генов для измерения уровня
экспрессии генов-мишеней JAK/STAT- пути
Для измерения уровня экспрессии генов-мишеней сигнального пути необходимо выбрать нормировочные гены, активность которых не изменяется при обработке перванадатом. Мы определяли уровень экспрессии генов актина 5C, гистона H1, ras2 при различных концентрациях перванадата (100, 300 и 500 мкМ) в зависимости от времени обработки (2, 4, 6 ч). Уровень экспрессии первых двух генов не изменяется по отношению к общему количеству РНК, а уровень экспрессии ras2 непосто-
и и
а
св
<ч
IS
w
св О
и и
Я
св
<ч
и
У
св О
ч о О
П
Рис. 4. Микроскопия клеток S2 до и после обработки перванадатом. Окрашивание ядра красителем DAPI (а, г), ядерной оболочки антителами к ламину (б, д) и антителами к STAT (в, е).
Уровень транскрипции гена актина 5C относительно гена гистона H1 1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 ч 2 4 6 246 246 ч 100 мкМ 300 мкМ 500 мкМ
Уровень транскрипции гена ras2 относительно гена гистона H1 1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 ч 2 4 6 246 246 ч 100 мкМ 300 мкМ 500 мкМ
Рис. 5. Уровень экспрессии нормировочных генов друг относительно друга в присутствии перванадата. Количество
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.