ОНТОГЕНЕЗ, 2015, том 46, № 5, с. 304-312
БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ ПОЗВОНОЧНЫХ
УДК 577:[591.134.5:597.552.511]
АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО И УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА И УРОВЕНЬ НЕКОТОРЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У МОЛОДИ ЛОСОСЯ (SALMO SALAR L.),
РАЗЛИЧАЮЩЕЙСЯ ВОЗРАСТОМ И МАССОЙ © 2015 г. М. В. Чурова, О. В. Мещерякова, А. Е. Веселов, Н. Н. Немова
Институт биологии Карельского научного центра РАН 185910 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 E-mail: mchurova@yandex.ru Поступила в редакцию 03.10.2014 г. Окончательный вариант получен 08.05.2015 г.
С целью изучения механизмов регуляции метаболизма у молоди атлантического лосося (Salmo salar L.) в процессе его роста, развития и формирования размерной разнокачественности исследовали возрастные изменения активности ферментов энергетического и углеводного обмена, в том числе уровень экспрессии гена тяжелой цепи миозина, индекс РНК/ДНК в белых мышцах и печени у особей 0+, 1+ и 2+, а также взаимосвязь данных показателей с массой особей. Установлен разнонаправленный характер изменения активности ферментов аэробного и анаэробного энергетического обмена, а также снижение уровня показателей синтеза белка с увеличением возраста особей. При этом выявлена положительная взаимосвязь активности цитохромоксидазы, лактатдегидрогеназы, альдола-зы, уровня экспрессии гена миозина в мышцах, активности цитохромоксидазы, глюкозо-6-фофат-дегидрогеназы и 1-глицерофосфатдегидрогеназы в печени с массой особей лосося внутри возрастных групп.
Ключевые слова: ферменты, энергетический обмен, углеводный обмен, экспрессия генов, РНК/ДНК, лосось, размеры.
Б01: 10.7868/8047514501505002Х
ВВЕДЕНИЕ
Важнейшим метаболическим фактором, определяющим процессы роста и развития рыб, является уровень энергетического обмена. Достаточный уровень образования АТФ определяет активный рост и развитие организма рыб, особенно в период раннего онтогенеза и в первые годы жизни, когда требуются большие энергетические затраты на синтез структурных, функциональных и запасных соединений. Энергетический обмен на разных этапах индивидуального развития имеет свои особенности, связанные с возрастными изменениями различных параметров организма в процессе жизнедеятельности. Так, например, вклад в суммарное потребление энергии таких процессов, как рост, дифференцировка и формообразование значительно меняется на разных стадиях развития (Озернюк, 1985). Процесс дифференциации рыб по размерам в пределах одной генерации также в значительной степени взаимосвязан с уровнем энергетического обмена и с общим уровнем метаболизма. Имеются данные литературы о том, что
активность ферментов энергетического и углеводного обмена наряду с молекулярно-генетиче-скими показателями в мышцах — индексом РНК/ДНК и уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина, взаимосвязаны с процессами роста рыб, отражают возрастные и сезонные изменения метаболизма, а также коррелируют с размерно-весовыми показателями особей, что продемонстрировано для различных видов рыб (Overturf, Hardy, 2001; Imsland et al., 2006; Gauthier et al., 2008; Vinagre et al., 2008; Koed^ et al., 2010).
Атлантический лосось (Salmo salar L.) является важным объектом для изучения процесса регуляции процессов роста и развития у рыб в раннем онтогенезе. Жизненный цикл лососевых рыб включает разнообразные этапы развития со сложной системой адаптаций (Казаков, 1998). Среди особей одной генерации может наблюдаться значительная дифференциация рыб по размерам и темпам роста, влияющая на возраст начала смол-тификации (Шустов, 1983; Павлов и др, 2007). Установлено также, что уровень энергетического
и углеводного обмена молоди лосося влияет на выживаемость мальков, их активность, размеры, а также является одним из важнейших факторов, определяющих стратегию выбора места обитания при расселении сеголеток в различные по гидрологическим условиям участки рек (Павлов и др., 2007).
Изучение биохимических и молекулярно-ге-нетических механизмов регуляции метаболизма в процессе дифференциации особей по размерам позволит расширить представления об особенностях роста и развития рыб в раннем онтогенезе. В данной работе у молоди атлантического лосося (Salmo salar L.) в зависимости от возраста и размеров особей определяли активность ферментов аэробного и анаэробного обмена (цитохром с окси-дазы (ЦО), малатдегидрогеназы (МДГ), лактатде-гидрогеназы (ЛДГ)), углеводного обмена (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ), 1-глицерофос-фатдегидрогеназы (1-ГФДГ), альдолазы) в белых мышцах и печени, индекс РНК/ДНК и уровень экспрессии тяжелой цепи миозина (MyHC) в белых мышцах особей возрастных групп 0+, 1+ и 2+.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования выполнены с использованием Центра коллективного пользования научным оборудованием ИБ КарНЦ РАН.
Исследовали молодь атлантического лосося (Salmo salar L.) возраста 0+, 1+, 2+. Место отлова — река Индера (Кольский полуостров). Сбор материала проводили в летнее время при температуре воды 13.5—15°C. Использовался электролов (аппарат Fa-2 норвежского производства). После отлова мальков выдерживали 1 сутки в садках. Каждую особь измеряли и взвешивали, кусочки тканей замораживали в жидком азоте, и далее хранили при —80°C до начала анализа. Данные по размерно-весовым показателям отловленной молоди лосося представлены в таблице 1.
Определение активности ферментов. Активность ферментов определяли в белых мышцах рыб в возрасте 0+, 1+ и 2+. Активность ферментов печени была определена только у особей возраста 1+ и 2+ в связи с небольшой массой этого органа у сеголеток (0+) недостаточной для взятия
навески. Ткань гомогенизировали в 0.01 М Трис-HCl буферном растворе (рН 7.5). Общую активность ферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ, 1.1.1.27), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ 1.1.1.49), малатдегидрогеназы (МДГ, 1.1.1.37) в органах рыб определяли по общепринятым методикам (Кочетов, 1980). Активность альдолазы (КФ 4.1.2.13) определяли по методике Beck в модификации Ананьева и Обуховой (Колб, Камышников, 1976). Активность цитохром с оксидазы (ЦО, КФ 1.9.3.1.) определяли по методу Смита (Smith, 1955).
Тотальную РНК выделяли из белых мышц по Хомчински и Сакхи (Chomczynski, Sacchi, 1987) с помощью набора "для выделения тотальной РНК Yellow Solve" (Клоноген, С.-Петербург). ДНК белых мышц выделяли методом Альанаби и Марти-неса (Aljanabi, Martinez, 1997). Концентрации РНК и ДНК определяли спектрофотометрически (спектрофотометр "SmartSpec Plus", BioRad, США).
Уровень экспрессии генов тяжелой цепи миозина определяли в белых мышцах методом поли-меразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Тотальную РНК обрабатывали ДНКазой (10 ед/мл) (Силекс, Россия). Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали из препарата тотальной РНК с использованием MMLV-обратной транскриптазы и случайных гексонуклеотидов (набор "Синтез первой цепи ДНК", Силекс). Концентрацию кДНК измеряли спектрофотометрически. Амплификацию проводили на приборе i-Cycler с оптической приставкой IQ5 (BioRad) с использованием реакционной смеси 2.5х для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Синтол, Россия). Праймеры для фактора элонгации и тяжелой цепи миозина подбирали с помощью программы Beacon Designer 5.0. Последовательности праймеров следующие: миозин (MyHC) (GenBank Z48794) прямой 5'-GCTGAGAAGGAC-GAGGAGATG-3', обратный 5'-GCCTGCCTGTT-GGAGTGG-3'; фактор элонгации (Ef-1) (GenBank AF321836) прямой 5'-TTGCTGGTGGTGTTG-GTGAG-3', обратный 5'-AAACGCTTCTGGCTG-TAGGG-3'. Протокол ПЦР: денатурация ДНК при 95°C 5 мин; повторяющиеся циклы (45): денатурация ДНК при 95°C 20 с, отжиг праймеров при 59°C по 30 с, элонгация ДНК при 72°C по 30 с,
Таблица 1. Размерно-весовые характеристики особей лосося трех возрастных групп
Показатель 0+ 1 + 2+
АС, см M ± m 4.45 ± 0.08 7.26 ± 0.11 9.66 ± 0.20
min- -max 3.2-5.3 6.3-8.7 8.6-10.3
Вес, г M ± m 0.87 ± 0.04 3.83 ± 0.17 8.25 ± 0.51
min- max 0.28-1.35 2.30-6.24 5.67-10.20
Количество особей 25 25 10
ЕА 35 30 25 20 15 10 5 0
(а)
ЦО ЛДГ МДГ
□ 0+ □ 1+ П2+
Альдолаза
ЕА 4
а 3 Я
Р
%
t2
i4 1 К
Р
0
(б)
МуНС
0+ 1+ 2+
Рис. 1. Активность ферментов (ЕА, мкмоль/мин/г ткани) (а) и уровень экспрессии гена тяжелой цепи миозина (мРНК МуНС/мРНК Е/-1) (б) в мышцах особей лосося разных возрастных групп, М± т. Для ЦО значения представлены в
ЕА х 10, для ЛДГ и альдолазы — ЕА х 10
различия достоверны приp < 0.05.
*
*
с последующей процедурой плавления фрагментов ДНК. Концентрацию матричной РНК в виде кДНК определяли по стандартной кривой (Gahr et al., 2008). Уровень экспрессии гена миозина нормализовали по уровню экспрессии рефе-ренсного гена Ef-1. Данные выражались как отношение концентрации мРНК исследуемого гена к концентрации мРНК Ef-1.
Для статистической обработки данных использовали общепринятые методы с использованием пакетов программ MS Excel и StatGraphics 2.5 for Windows. Сравнение выборок проводили с применением непараметрического критерия Вил-коксона-Манна-Уитни. Взаимосвязь исследуемых показателей с размерами особей и между собой оценивали при помощи линейной регрессии и корреляционного анализа (Коросов, Горбач, 2007).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Уровень биохимических и молекулярно-генетических показателей в мышцах особей лосося разного возраста
При исследовании уровня аэробного и анаэробного энергетического обмена был установлен различный характер возрастных изменений активности соответствующих ферментов. Отмечена повышенная активность ЦО, ключевого фермента дыхательной цепи митохондрий, у рыб 1+ по сравнению с особями 0+ и более низкая активность ЦО у рыб в возрасте 2+ до уровня у сеголеток (рис. 1а). Эти результаты указывают на различие в уровне аэробного обмена у возрастных групп молоди лосося.
В отличие от активности ЦО, уровень активности ЛДГ в исследованном возрастном ряду увеличивался (рис. 1а). Активность фермента ЛДГ в
белых мышцах рыб связана преимущественно с участием его в анаэробном гликолизе и используется как индикатор уровня анаэробного гликолиза (Somero, Childress, 1980). Этот процесс является ведущим в энергообеспечении
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.