»
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1997, том 23, № 3, с. 174-182
УДК 577.152.344.04:541.64
АКТИВНОСТЬ а-ХИМОТРИПСИН А, ИММОБИЛИЗОВАННОГО В НАНОКАПСУЛЫ ПОЛИ(1Ч^-ДИДОДЕЦИЛ-1Ч,1Ч-ДИАЛЛИЛАММОНИЙБРОМИДА)
© 1997 г. Ю. Е. Шапиро#, Е. Г. Пыхтеева, Г. В. Федорова
Физико-химический институт им. A.B. Богатского HAH Украины, 270080, Одесса, Черноморская дорога, 86 Поступила в редакцию 30.05.96 г.
Синтезированы биокаталитические системы из нанокапсул, содержащих а-химотрипсин во внутренней водной полости, способные функционировать как в органическом растворителе, так и в водной среде. Для этого обращенные гидратированные мицеллы Г^.Ы-дидодецил-М^-диаллилам-монийбромида (DDAB) в циклогексане (w0 = 22), инкапсулировавшие а-химотрипсин, подвергали УФ-инициированной полимеризации. После осаждения ацетоном нанокапсулы переводили в водную фазу добавлением аэрозоля ОТ с последующим ультразвуковым диспергированием. При этом формируются моноламеллярные липосомы, внутренний монослой которых представляет собой полимерную сетку из поли-DDAB, в которой а-химотрипсин находится в водном окружении, а наружный монослой состоит из молекул аэрозоля ОТ. Наружный диаметр нанокапсул, по данным светорассеяния, составил в среднем 20 нм. При гидролизе и-нитрофенил ацетата а-химотрипсином, включенным в липосомы, величина не изменяется, значение ¿кат уменьшается в 1.2 раза, а константы ингибировапня продуктом реакции Кр - в 1.6 раза. Иммобилизованный внутри нанокапсул а-химо-трипсин обладает высокой термостабильностью (активен до 80°С). Полимерная сетка препятствует конформационной перестройке молекулы фермента при нагревании.
Ключевые слова: а-химотрипсин иммобилизованный, бислойные везикулы, нанокапсулы, мономерные ПА В, ферментативный катализ.
Высокая каталитическая активность, позволяющая проводить химические реакции в мягких условиях, и непревзойденная селективность действия ферментов открывают широкие перспективы для использования биокатализа в процессах органического синтеза [1, 2]. Однако применению ферментов существенно мешает то обстоятельство, что они сохраняют свои уникальные свойства лишь в водном растворе в узком диапазоне рН и температур. Переход от воды как среды реакции к органическому растворителю или выход из оптимального диапазона рН и температур в водной фазе сопровождается либо денатурацией фермента, либо резким падением его каталитической активности с утратой субстратной специфичности [2]. Этих неприятностей можно избежать полностью или частично путем создания водо- или органорастворимых биокагалитичес-ких систем, в качестве которых можно рассматривать ферменты, иммобилизованные на поверхности полимерного носителя [3-5] или включенные в обращенные мицеллы из катионных [6],
Сокращения: БВАВ - М,М-дидодецил-М,Ы-диаллиламмоний-бромид, ПАВ - поверхностно-активное вещество, АОТ -аэрозоль ОТ (диизооктилсульфосукцинат натрия). # Автор для переписки.
анионных [7, 8] или неионогенных [9,10] ПАВ, во всевозможные лиотропные мезофазы [11, 12] или липосомы [13, 14]. При этом фермент оказывается защищенным от денатурирующего воздействия среды, и его активность практически не снижается [7, 15].
Для известных биокаталитических ансамблей такого рода измерена ферментативная активность [4-10, 12-15], а также определена молекулярная структура [5, 11, 16, 17]. Строение биокаталитических ансамблей, в том числе упаковка и конформация молекул ПАВ и липидов, локализация и характер гидратации молекул фермента, определяет каталитическую активность и механизм взаимодействия биокатализатора с субстратом. Молекулы воды, по-видимому, выполняют регуляторную роль и контролируют надмолекулярную структуру ансамблей [17-19].
Включение ферментов как в обращенные мицеллы, так и в фосфолипидные липосомы иногда приводит к увеличению их активности [12, 15], хотя в большинстве случаев активность несколько снижается [3, 6, 12]. Последнее, впрочем, не препятствует использованию подобных биокаталитических систем. Ограничение состоит в ином. Обращенные мицеллы, инкапсулирующие молекулы
фермента, формируются в неполярном окружении. Поэтому такие системы предполагают использование субстратов, растворимых в органических растворителях. С другой стороны, ферменты, включенные в липосомы, находятся в водной фазе, поэтому они пригодны лишь для водорастворимых субстратов. В связи с этим принципиальный интерес представляет создание биокаталитических ансамблей, которые могли бы функционировать как в водной, так и в неводных средах и не требовали бы специальных условий для хранения. Этим требованиям вполне может удовлетворять система, в которой молекулы фермента находятся внутри полимерных наногранул. Полимерные нанограну-лы защищают фермент от денатурации органическим растворителем, способствуют расширению температурного диапазона их действия и могут существовать в сухом виде при необходимости длительного хранения.
Для формирования полимерных наногранул предложены два способа. Первый заключается в полимеризации мицелл и везикул из мономерных ПАВ [20—22] под действием УФ-облучения или при химическом инициировании [23,24]. В зависимости от расположения кратных связей в структуре мономерного ПАВ полимеризацию можно провести либо по полярному, либо по липофильному фрагментам дифильной молекулы ПАВ [21, 22]. Для иммобилизации молекул фермента наибольший интерес представляют мономерные ПАВ, содержащие гидрофильный полимеризуемый фрагмент, обращенный в мицеллах и везикулах во внутреннюю водную полость.
К числу подобных ПАВ относятся катионоак-тивные пиридиниевые или аммониевые соединения, имеющие винильные [20, 23], метакрилатные [25,26] или аллильные [24,26-33] группы. В зависимости от того, сколько алкильных цепей (одну или две) содержат молекулы этих соединений, они способны образовывать в воде мицеллы 120-27] или моноламеллярные везикулы [22,28-33]. К сожалению, диаметр этих везикул довольно велик -10-100 мкм [33].
Второй способ заключается в формировании наногранул путем полимеризации обращенных мицелл АОТ, содержащих модифицированный акрилоилхлоридом а-химотрипсин, акриламид и М,1Ч'-метш1енбисакриламид [34]. В этом случае молекула фермента оказывается ковалентно встроенной в частицы полимерного геля. Диаметр поли-акриламидных гранул зависит от степени гидратации мицелл н>0 = [Н20]/[А0Т] и концентрации акриламида и составляет 40-100 нм. Однако необходимость химической модификации молекул фермента и ПАВ делает этот способ неоправданно трудоемким.
Цель настоящей работы - иммобилизация немо-дифицированного а-химотрипсина внутри полимер-
ных нанокапсул, представляющих собой заполиме-ризованные на границах раздела фаз обращенные мицеллы Н^-дидодецил-К,М-диаллиламмонийбро-мида [(Н2С=СН-СН2)2№ {(СН2)И СН3) 2]Вг фБАВ) в циклогексане с включенными во внутреннюю водную полость молекулами фермента. Предлагаемый способ формирования нанокапсул совмещает достоинства вышеописанных двух способов и не обладает их недостатками.
По данным электронной микроскопии, при УФ-инициированной полимеризации 1Ч,1Ч-диалкил-1Ч,Г^-диаллиламмонийбромидов в составе их мицелл в воде [32] или бислойных везикул, полученных ультразвуковой обработкой их 0.01 М водных дисперсий [24], сохраняется структура исходных коллоидных частиц. Полимер представляет собой двумерную сетку на границе раздела фаз ПАВ-вода, причем гидрофобные алкильные фрагменты упакованы внутри прямых мицелл или бислоя подобно тому, как это установлено для фо-сфолипидных везикул [35]. Включение молекул фермента в везикулы позволяет получить в результате их полимеризации биокаталитические нанокапсулы, в которых фермент защищен двойной полимерной сеткой.
Следует заметить, что подобная биокаталитическая система обладает тремя существенными недостатками: 1) необходимо отделение гель-фильтрацией невключившегося фермента от нанокапсул. Эта операция, в общем несложная в случае фосфолипидных липосом, доставляет много неприятностей для твердых полимерных микрочастиц; 2) двойная полимерная сетка, несмотря на сравнительно большие размеры ячеек, существенно снижает коэффициенты трансмембрашюй диффузии субстрата из раствора к инкапсулйро-ванному ферменту и продуктов реакции - в обратном направлении Это может значительно уменьшить эффективные параметры ферментативной кинетики, в том числе из-за специфического инги-бирования продуктами реакции; 3) размеры липосом основной фракции дисперсии Г4,Г4-диалкил-Ы,!Ч-диаллиламмонийбромидон, обработанной ультразвуком, довольно велики и варьируют в широком диапазоне. Их наружный диаметр составляет 60-230 нм [30]; при полимеризации он уменьшается, но незначительно [22].
Использование обращенных мицелл из мономерного ПАВ, содержащих солюбилизованную воду в качестве внутреннего монослоя формируемой впоследствии бислойной везикулы, позволяет варьировать диаметр внутренней водной полости в достаточно широких пределах [8, 12], уменьшая его вплоть до среднего диаметра глобулы а-химотрипсина (4.3 нм) (а-химотрипсин, инкапсулированный в обращенных мицеллах, имеет максимальную активность при совпадении размеров
в неполярном растворителе
1 - радикальная полимеризация
2 - осаждение ацетоном
3 - растворение
П. ^^—г\~ ВВ0Де
(с добавкой
Рис. 1. Схема получения ферментсодержащих нанокапсул.
внутренней полости мицеллы и солюбилизован-ной белковой глобулы [36]).
Процесс получения биокаталитической системы с а-химотрипсином схематически представлен на рис. 1. После УФ-инициированной полимеризации ЬБАВ вокруг ферментной глобулы формируется сетка поли-ООАВ. Степень полимеризации можно контролировать по изменениям в ИК- и пС-ЯМР-спектрах дисперсий, подвергнутых УФ-облучению.
Наиболее удобна для этого в ИК-спектре полоса при 1636 см-1, соответствующая валентным колебаниям двойной связи аллильного фрагмента. Отношения интенсивности этой полосы к ин-тенсивностям полос симметричных (у5 2838 см-1) и асимметричных 2912 см'1) валентных колебаний С-Н-связи СН2-групп циклогексана (внутренний стандарт интенсивности) при полимеризации уменьшаются втрое. При использовании в качестве стандарта интенсивности полос валентных колебаний С-Н-связ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.