МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 2, с. 163-168
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.282.23.577.[152+124.5]
АКТИВНОСТЬ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ КСИЛОЗОАССИМИЛИРУЮЩИХ ДРОЖЖЕЙ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ СКОРОСТИ ПОСТУПЛЕНИЯ КИСЛОРОДА В ФЕРМЕНТАЦИОННУЮ СРЕДУ
© 2004 г. Е. Н. Яблочкова*, О. И. Болотникова*, Н. П. Михайлова*, Н. Н. Немова**, А. И. Гинак*
*Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технологический университет)
**Петрозаводский государственный университет Поступила в редакцию 19.08.02 г.
Исследованы активности ксилитдегидрогеназы и ксилозоредуктазы Pichia stipitis, Candida shehatae, C. didensiae, C. intermediae, C. tropicalis, Kluyveromyces marxianus, P. guillermondii, Pachysolen tannophilus и Torulopsis molishiama при различной скорости поступления кислорода (OTR) в ферментационную среду: 0, 5 и 140 ммоль/(л ч). Наибольшие активности ферментов отмечены у P. stipitis и C. shehatae. Кси-литдегидрогеназа всех исследованных дрожжей характеризуется НАД+-специфичностью независимо от интенсивности принудительной аэрации. Ксилозоредуктазу C. didensiae, C. intermediae, C. tropicalis, Kl. marxianus, P. guillermondii и T. molishiama отличает НАДФН-зависимость, а у P. stipitis, C. shehatae и Pa. tannophilus - двойная НАДФН/НАДН-специфичность обсуждаются причины влияния OTR на активность и специфичность ключевых ферментов ксилозоассимилирующих дрожжей.
Ключевые слова: дрожжи, скорость поступления кислорода (OTR), ксилозоредуктаза, ксилитдегид-рогеназа.
Способность дрожжей утилизировать ксило-зосодержащие субстраты обуславливается наличием у них ферментов ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы, превращающих О-ксилозу в О-ксилулозу, которая затем вступает в основные метаболические пути - пентозофосфатный и три-карбоновый циклы, гликолиз [1, 2]. При неполном окислении пятиатомного сахара одни культуры дрожжей образуют этиловый спирт, а другие накапливают ксилит, предшествующий образованию О-ксилулозы [3-5]. Накопление ксилита или этанола наблюдается при значительном ограничении дыхания дрожжей. Предполагают, что недостаток кислорода в ферментационной среде приводит к изменению эффективности функционирования ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы [3, 6-8]. Внутриклеточный метаболизм О-ксилозы в этом случае блокируется на стадии образования пятиатомного спирта - ксилита [1, 3, 6, 7]. Однако механизм влияния кислорода на активность и коферментную специфичность ксилозо-редуктазы и ксилитдегидрогеназы до сих пор не выяснен.
Цель настоящей работы заключалась в анализе особенностей функционирования ксилозоре-дуктазы и ксилитдегидрогеназы дрожжей при различных скоростях поступления кислорода в ферментационную среду.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали штаммы ксилозоассимилирующих дрожжей, относящихся к родам: Candida (C. didensiae Ф-3, C. intermediae TabII (85), C. tropicalis W-1, C. shehatae Y-1632), Pichia (P. guillermondii Y-1017, P. stipitis Y-2160), а также Klyver-omyces marxianus Y-488, Torulopsis molishiama 55, Pachysolen tannophilus Y-1532, Y-1533, Y-1634, происхождение которых указано ранее [9]. По способности образовывать различные продукты конверсии D-ксилозы эти культуры были подразделены на группы: ксилитпродуцирующие (I группа), образующие сопоставимые количества ксилита и этилового спирта (II группа) и этанолпродуциру-ющие (III группа) [9]. Рост дрожжей поддерживали на стандартных питательных средах [10]. Приготовление среды для ферментаций и выращивание инокулята осуществляли согласно [10]. Все ферментации проводили на среде с 2%-ной D-кси-лозой в трех режимах. 1) В 100-мл круглодонных колбах со 100 мл жидкой питательной среды при 30 ± 2°С в течение 24 ч без перемешивания, посевной материал вносили в количестве 10.0 ± 0.5 г/л (по массе сухих клеток - м.с.к.). 2) В 250-мл колбах Эрленмейера со 100 мл жидкой среды на термостатированной круговой качалке УВНТ-12-250 при 100 об/мин, 30 ± 2°C в течение 24 ч, посевной
163
2*
Таблица 1. Образование ксилита, этанола и биомассы дрожжами Ра. гаппорНИж У-1532 при различных скоростях поступления кислорода в ферментационную среду
Показатели ферментации Объемная скорость поступления кислорода (OTR), ммоль/(л ч)
0.0 5.0 140.0
Степень потребления О-ксилозы, % <5.0 95.0 95.0
Скорость утилизации О-ксилозы, г/(л ч) <0.01 0.46 0.91
Выход продукта, г/г:
ксилит <0.01 0.16 <0.01
этанол <0.01 0.25 <0.01
биомасса <0.01 0.08 0.41
Объемная продуктивность, г/(л ч):
ксилит <0.01 0.08 <0.01
этанол <0.01 0.13 <0.01
биомасса <0.01 0.05 0.53
Удельная скорость роста (ц), ч-1 <0.01 0.05 0.23
Примечание. Жирным шрифтом выделены наибольшие значения, полученные в эксперименте. Максимальная ошибка в каждой экспериментальной точке не превышает 5%.
материал вносили в количестве 6.0 ± 0.5 г (м.с.к.)/л. 3) В литровых колбах Эрленмейера со 100 мл жидкой среды на роторной качалке при 200 об/мин, 30 ± 2°С в течение 24 ч, посевной материал вносили в количестве 1.0 ± 0.5 г (м.с.к.)/л. Скорость поступления кислорода в ферментационную среду -OTR (oxygen transfer rate, ммоль/(л ч)) оценивали сульфитным методом в соответствии с [11]. Активность и коферментную специфичность ксило-зоредуктазы (КФ 1.1.1.21) и ксилитдегидрогена-зы (КФ 1.1.1.9) определяли в бесклеточных экстрактах [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние OTR на продукцию ксилита и этанола у дрожжей
Скорость поступления молекулярного кислорода в ферментационную среду, определяемая, в значительной степени, условиями аэрирования [3, 8], регулирует направленность внутриклеточного превращения D-ксилозы в те или иные метаболиты. В качестве модельного объекта использовали дрожжи Pa. tannophilus, образующие сопоставимые количества ксилита и этилового спирта при ферментации D-ксилозы [7, 10]. Оценивали потребление D-ксилозы этими дрожжами, накопление биомассы, спирта и ксилита при разных значениях OTR (табл. 1).
Отсутствие принудительной аэрации (ОТИ = = 0.0 ммоль/(л ч)) в 1-м режиме культивирования приводило лишь к незначительному потреблению пятиатомного сахара, необходимому для поддержания жизнеспособности дрожжевой культуры без образования биомассы и продуктов неполного окисления О-ксилозы. Условия, при которых не осуществляется ассимиляция пятиатомного сахара, названы анаэробными [3, 8].
При 2-м режиме ферментации (ОТИ = = 5.0 ммоль/(л ч)) О-ксилоза уже активно потреблялась, но удельная скорость роста оказалась незначительной (не превышала 0.05 ч-1). В этом случае дрожжи продуцировали ксилит и этиловый спирт. Условия, способствующие образованию продуктов неполного окисления О-ксилозы, по аналогии с опубликованными в источниках, можно считать микроаэробными [4, 7].
ОТИ, равная 140.0 ммоль/(л ч) в 3-м режиме культивирования обуславливала двукратное возрастание скорости потребления О-ксилозы, удельная скорость роста при этом составила 0.23 ч-1. Такие условия характеризовались наибольшим выходом и объемной продуктивностью биомассы (табл. 1) на фоне отсутствия ксилита и этанола в культуральной среде. Режим ферментации, способствующий биосинтетическим процессам в клетке (росту биомассы), можно характеризовать как аэробный [6].
Таким образом, подобрав условия принудительной аэрации среды, можно не только регулировать образование ксилита, этилового спирта и биомассы, но также исследовать влияние кислорода на активность ферментов - ксилозоредукта-зы и ксилитдегидрогеназы, играющих значительную роль в этих процессах.
Специфичность ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы в различных условиях принудительной аэрации
Известно, что коферменты, входящие в состав активных центров ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы, обуславливают эффективность биокатализа [1, 13, 14]. Поэтому изменение кофер-ментспецифических активностей в зависимости от режимов аэрации питательной среды должно оказывать значительное влияние на общие активности указанных ферментов.
НАДФН/НАДН-удельные активности ксилозоредуктазы при различных ОТИ приведены в табл. 2. Так, у дрожжей I группы наблюдалась высокая специфичность фермента к НАДФН-ко-ферменту, которая составляла 97-98% общей активности независимо от скорости поступления кислорода среду. Это свидетельствует о существовании лишь одной формы ксилозоредуктазы в клетках дрожжей, продуцирующих ксилит.
g Таблица 2. Удельные специфические активности ксилозоредуктазы/ксилитдегидрогеназы дрожжей в различных условиях аэрации S
4 О м
5 о а о
4
5 »
Активность ксилозоредуктазы/ксилитдегидрогеназы, мкмольДмг мин)*
Группа Вид дрожжей, штамм 0.0 ммольДл ч)** 5.0 ммольДл ч)** 140.0 ммольДл ч)**
НАДФН/НАДФ+ НАДН/НАД+ НАДФН/НАДФ+ НАДН/НАД+ НАДФН/НАДФ+ НАДН/НАД+
I С. didensiae Ф-3 0.03/<0.01 < 0.01/< 0.01 0.63/<0.01 0.03/<0.01 1.66/0.09 0.03/1.11
С. intermedíele TablI (85) 1.39/0.06 0.08/0.35 4.74/0.21 0.16/3.62 6.53/0.23 0.11/2.68
С. tropicalis W-l 0.80/0.04 0.04/0.48 6.43/0.06 0.14/1.10 4.27/0.08 0.15/6.25
Kl. marxianus Y-488 0.34/<0.01 < 0.01/< 0.01 0.16/<0.01 <0.01/0.04 0.04/0.04 <0.01/0.47
P. quillermondii Y-1017 0.40/0.04 0.01/0.50 0.61/< 0.01 0.02/0.18 0.76/<0.01 <0.01/3.49
T. molishiama 55 <0.01/<0.01 < 0.01/< 0.01 0.11/0.01 <0.01/0.01 0.02/<0.01 <0.01/0.47
II Pa. tannophilus Y-1532, Y-1533, Y-1634 0.07-0.14/<0.01-0.04 0.04-0.05/0.43-1.00 2.00-2.10/<0.01-0.12 1.39-1.56/4.04-5.26 2.10-2.34/<0.01-0.15 0.12-0.18/4.08-5.28
III C. shehatae Y-1632 5.02/0.20 2.31/8.29 3.40/0.42 4.93/13.53 4.81/0.53 3.10/15.37
P. stipitis Y-2160 10.6/0.56 5.96/17.50 4.84/0.27 10.37/8.37 8.24/0.42 4.53/9.92
г
(О
(О
о о
>
я н
К и X о о н tr
й S л и и
№ нч
X
о и ч
£ и X н о и
Примечание. Специфические активности ксилитдегидрогеназы в присутствии НАДФ+ и НАД+-коферментов выделены жирными шрифтом. Относительная ошибка в каждой экспериментальной точке не превышает 5%. * За единицу активности принято количество фермента, способное восстановить или окислить 1 мкмоль НАД(Ф) (Н) за 1 мин. **Указаны скорости поступления кислорода в культуральную среду (СУШ), соответствующие анаэробному, микроаэробному и аэробному режимам.
ON (Л
(а)
□ 7
□ 2 □ 3
(б)
Активность фермента
150 100 50 0
150 10
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.