научная статья по теме АКТИВНОСТЬ МОЛЕКУЛ α ИЗОФОРМЫ НУКЛЕОЗИДДИФОСФАТКИНАЗЫ (НДФК α), СПОСОБНЫХ СВЯЗАТЬСЯ С НАРУЖНОЙ МЕМБРАНОЙ МИТОХОНДРИЙ, СОСТАВЛЯЕТ МЕНЕЕ 10% ОБЩЕЙ АКТИВНОСТИ НДФК, ПРИСУТСТВУЮЩЕЙ В ЦИТОПЛАЗМЕ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ Химия

Текст научной статьи на тему «АКТИВНОСТЬ МОЛЕКУЛ α ИЗОФОРМЫ НУКЛЕОЗИДДИФОСФАТКИНАЗЫ (НДФК α), СПОСОБНЫХ СВЯЗАТЬСЯ С НАРУЖНОЙ МЕМБРАНОЙ МИТОХОНДРИЙ, СОСТАВЛЯЕТ МЕНЕЕ 10% ОБЩЕЙ АКТИВНОСТИ НДФК, ПРИСУТСТВУЮЩЕЙ В ЦИТОПЛАЗМЕ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ»

БИОХИМИЯ, 2012, том 77, вып. 6, с. 731 - 741

УДК 577.152.2

АКТИВНОСТЬ МОЛЕКУЛ а ИЗОФОРМЫ НУКЛЕОЗИДДИФОСФАТКИНАЗЫ (НДФК а), СПОСОБНЫХ СВЯЗАТЬСЯ С НАРУЖНОЙ МЕМБРАНОЙ МИТОХОНДРИЙ, СОСТАВЛЯЕТ МЕНЕЕ 10% ОБЩЕЙ АКТИВНОСТИ НДФК, ПРИСУТСТВУЮЩЕЙ В ЦИТОПЛАЗМЕ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ*

© 2012 г. Т.Ю. Липская**, В.В. Воинова

Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (495)939-3955, электронная почта: tlipskaya@yandex.ru

Поступила в редакцию 06.02.12 После доработки 28.02.12

Установлено, что при инкубации в присутствии 3,3 мМ М^С12 постоянного объема цитозоля печени крысы с возрастающими количествами белка митохондрий связывание нуклеозиддифосфаткиназы (НДФК) из цитозоля с митохондриальными мембранами характеризуется кривой с насыщением. Максимальная связавшаяся активность НДФК составила менее 9% добавленной активности. Анализ результатов предполагает, что с мембранами митохондрий связывался только один изозим НДФК. По данным иммуноферментно-го анализа, это НДФК а, гомологичная человеческой НДФК-В. Установлено, что субстраты НДФК, гексо-киназы и глицеринкиназы, а также БССБ и пальмитиновая кислота, не влияли на связь НДФК с митохондриальными мембранами. Сделан вывод, что участки связывания НДФК на наружной мембране митохондрий не идентичны участкам связывания гексокиназы и глицеринкиназы.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: нуклеозиддифосфаткиназа, митохондрии, наружный компартмент, печень, изози-мы, связывание.

В физиологических условиях нуклеозиддифосфаткиназа (EC 2.7.4.6, НДФК) катализирует реакции синтеза нуклеозидтрифосфатов (NTPs) из ATP и соответствующих нуклеозиддифосфа-тов. Эти нуклеозидтрифосфаты участвуют в основных анаболических процессах [1]. В тканях человека обнаружены десять генов, кодирующих десять типов гомологичных субъединиц, служащих для построения изоферментов НДФК. НДФК проявляет активность протеинкиназы и 3'-5'-экзонуклеазы, вступает во взаимодействие со многими белками, участвуя, таким образом, в регуляции подвижности клеток, роста и развития, злокачественного роста и апоптоза. Ката-

Принятые сокращения: НДФК — нуклеозиддифосфаткиназа; нмНДФК — НДФК, связанная с наружной мембраной митохондрий; лейпептин — ацетил-лейцил-лейцил-аргининал; Е-64 — L-транс-эпоксисукцинил-лей-циламид-(4-гуанидо)-бутан; АР5А — р1р5-ди(аденозин)пен-тафосфат; DCCD — ^№-дициклогексилкарбодиимид; PMSF — фенилметилсульфонилфторид.

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 12-021, 08.04.2012.

** Адресат для корреспонденции.

литическая и регуляторная функции могут осуществляться независимо одна от другой. Обилие изоформ НДФК и их разная внутриклеточная локализация позволяют предположить, что каждая изоформа выполняет в клетке специфическую функцию и внутриклеточная локализация принципиально важна для выполнения этой функции (см., например, обзоры [2—5]).

В клетках печени НДФК локализована в цитоплазме, а также связана с мембранами [6, 7]. В митохондриях фермент был найден в наружном компартменте и в матриксе [8, 9]. Мы показали, что в митохондриях печени крысы вся активность НДФК наружного компартмента локализована на наружной поверхности наружной мембраны (нмНДФК) [10, 11]. Специфические функции НДФК наружного компартмента до сих пор не были исследованы.

Мы показали, что нмНДФК митохондрий печени участвует в функциональном сопряжении с системой окислительного фосфорилиро-вания; благодаря этому часть АБР, образованного во время НДФК-реакции, прямо переносится в матрикс митохондрий, минуя стадию смешивания с АБР среды [12].

731

5*

Мы впервые показали, что способностью к функциональному сопряжению обладает только небольшая часть наиболее прочно связанных с митохондриями молекул нмНДФК, которые ответственны за 22—24% общей активности фермента [11].

Способностью к функциональному сопряжению с системой окислительного фосфорили-рования обладают также гексокиназа и глице-ринкиназа [13, 17]. Получены указания на то, что оба фермента связываются с одним и тем же участком порина [18, 19]. В настоящее время не известно, есть ли партнер-антагонист нмНДФК на наружной мембране митохондрий.

В настоящей работе мы продолжили изучение свойств нмНДФК. Ранее было показано, что активность нмНДФК составляет только ~13% суммарной активности фермента в наружном компартменте митохондрий и в растворимой фракции [10]. При таком большом избытке активности свободной НДФК над митохондри-ально-связанной можно предположить, что связывание фермента с митохондриями лимитировано числом специфических участков связывания на наружной поверхности наружной мембраны. С другой стороны, в цитоплазме клеток печени присутствуют несколько изоформ НДФК [6]; фермент легко образует комплексы с другими белками [3] и относительно низкомолекулярными соединениями, например, моносахаридами [20]. Поэтому нельзя исключить возможность того, что только небольшая часть общей активности НДФК, присутствующей в цитоплазме клеток печени, способна связываться с наружной поверхностью наружной митохонд-риальной мембраны.

Задачей нашей работы было выяснить, существует ли в цитоплазме клеток печени специфическая фракция молекул НДФК, способная связываться с наружной митохондриальной мембраной; идентифицировать изоформу НДФК, связанную с наружной мембраной, и сравнить эффекты веществ, влияющих на связь гексоки-назы и глицеринкиназы с мембранами митохондрий, с их действием на связь нмНДФК с мембранами.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы. Были использованы ATP, ADP, СТР, CDP, GTP, GDP, AP5A, БСА (обезжиренный) («Sigma Chemical Co», США), UDP («Reanal», Венгрия), лейпептин («MP Biomedicals, Inc», США), Е-64 («BIOMOL Research Labs, Inc», США), первичные мышиные моноклональные антитела на NME2 (ab60602) («Abcam», США).

Вторичные кроличьи поликлональные антитела на мышиный Ig G, конъюгированные с перок-сидазой хрена, были любезно предоставлены А.Г. Катрухой, профессором кафедры биохимии биологического факультета МГУ.

Связывание НДФК из цитозоля с мембранами митохондрий. Выделение митохондрий и солюби-лизация нмНДФК. Митохондрии выделяли из печени белых крыс массой 180—220 г в основном так, как описано в работе [12]. Среда выделения (СВ) содержала 0,28 М маннит, 2,1 мМ Hepes, pH 7,4. 10%-ный гомогенат центрифугировали 15 мин в центрифуге J2-21 («Beckman», Австрия) при 2000 об/мин в роторе JA-20. Супер-натант центрифугировали 10 мин при 8000 об/мин, измеряли объем полученного супернатанта (S), отбирали из него 10—15 мл, добавляли к ним лейпептин до конечной концентрации 50 мкМ и центрифугировали в течение 1 ч в центрифуге L-90K («Beckman Coulter Optima», Австрия) при 30 000 об/мин в бакет-роторе SW 55Ti. Полученный супернатант, содержащий все растворимые белки цитоплазмы, в том числе НДФК, будем называть в дальнейшем «цитозоль». Осадок митохондрий после центрифугирования при 8000 об/мин (осадок 1) суспендировали в СВ с лейпептином из расчета 2,7 мл на 1 г ткани. Суспензию осадка 1 перемешивали на магнитной мешалке при 2° в течение 2 ч и центрифугировали 10 мин в роторе JA-20 при 10 300 об/мин. Осадок митохондрий (осадок 2), лишенный большей части активности нмНДФК, суспендировали в СВ с лейпептином до конечной концентрации примерно 60 мг/мл. Измеряли общий объем суспензии (V1) и по разности между общим объемом и объемом добавленной СВ с лейпептином находили общий объем осадка 2 (V2). Полученные результаты использовали в дальнейших расчетах, а суспензию немедленно использовали в опытах по связыванию НДФК из цитозоля с мембранами митохондрий.

В некоторых опытах, представленных в табл. 1, митохондриальный осадок 1 суспендировали в СВ или в одной из следующих сред промывания: 3,33 мМ MgCl2, 0,27 М маннит, 2,1 мМ Hepes, pH 7,4 (среда с Mg2+) или 0,14 М Ка, 2,1 мМ Hepes, pH 7,4 (среда с высокой ионной силой). Митохондриальный осадок 2 суспендировали в соответствующей среде промывания до концентрации около 60 мг белка митохондрий в 1 мл. Суспензии хранили во льду и использовали в полярографических опытах.

Опыты по связыванию НДФК из цитозоля с мембранами митохондрий. Ряд пробирок содержал рассчитанный объем СВ с лейпептином, 1,15 мл цитозоля и MgCl2 до конечной концентрации 3,33 мМ. Реакцию начинали добавлением

Таблица 1. Некоторые характеристики препаратов митохондрий, хранившихся в разных средах промывания

Среда промывания митохондрий Прединкубация митохондрий Скорость окислительного фосфорилирования, нмоль ADP/мин на 1 мг белка Активность НДФК, нмоль CDP/мин на 1 мг белка J/CDP /VADP % ДК

СВ с MgCl2 (4) нет 335 ± 30 287 ± 35 85 ± 5,0 4,0 ± 0,2

С высокой ионной силой (4) нет 345 ± 58 264 ± 18 79 ± 13 4,8 ± 0,5

СВ (3) нет 315 ± 22 169 ± 38 54 ± 12 4,8 ± 0,4

СВ да 482 ± 75 (4) 64 ± 10 (3) 13 ± 0,3 (3) 6,1 ± 0,6 (4)

Примечание. В опытах с прединкубацией суспензию осадка митохондрий 1 перемешивали на холоде в течение 2 ч. ДК — коэффициент дыхательного контроля. В скобках указано число опытов. Остальные детали описаны в разделе «Методы исследования». Пояснения — в тексте.

40—400 мкл суспензии осадка 2, содержавшей от 2,5 до 25 мг белка. Контрольные пробы (на оставшуюся в осадке 2 активность нмНДФК) содержали 100—400 мкл суспензии осадка 2 и не содержали цитозоль; некоторые пробы с цито-золем не содержали MgCl2. Общий объем каждой пробы — 1,9 мл.

Все пробы одновременно встряхивали в течение 5 мин при 2° в приборе Termomixer comfort («Eppendorf», Германия) и центрифугировали 1 мин при 14 500 об/мин в центрифуге MiniSpin plus («Eppendorf»). Супернатант сливали и сохраняли, а осадки митохондрий (осадки 3) ополаскивали, наслаивая на них по 0,5 мл СВ с лейпепти-ном и MgCl2; затем стенки пробирок тщательно обсушивали и осадки суспендировали в СВ, добавляя по 35 мкл на каждые 30 мкл взятой суспензии осадка 2. Активность НДФК определяли полярографическим методом.

Дыхание митохондрий. Скорость потребления кислорода митохондриями при 22° определяли с помощью закрытого кислородного электрода Кларка и полярографа LP 7e («Laboratorni Pristroje Praha», Чехословакия). Основная среда инкубации содержала 85 мМ KCl, 110 мМ ман-нит, 0,

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком