БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 9, с. 1391 - 1404
УДК 577.152.1:582.32
АКТИВНОСТЬ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ТАЛЛОМЕ Anthoceros natalensis*
© 2015 А.В. Часов1**, Р.П. Бекетт2, Ф.В. Минибаева1
1 Казанский институт биохимии и биофизики, Казанский научный центр РАН, 420111 Казань, а/я 30; факс: +7(843)292-7347, электронная почта: chasov@kibb.knc.ru
2 School of Life Sciences, University of KwaZulu-Natal, Private Bag X01, Pietermaritzburg, Scottsville 3209, South Africa; fax: +27(33)260-5105
Поступила в редакцию 16.01.15 После доработки 15.04.15
Антоцеротовидные (Anthocerotophyta), одни из древнейших несосудистых наземных растений, происходят от общего предка с современными сосудистыми растениями. Благодаря своей высокой устойчивости к действию неблагоприятных факторов среды, антоцеротовидные представляют собой уникальную модель для изучения механизмов формирования устойчивости высших растений. В настоящей работе показано, что таллом Anthoceros natalensis характеризуется высокой редокс-активностью, изменяющейся при стрессе. Обезвоживание таллома сопровождается снижением активности внутриклеточных пероксидаз, ДОФА-пе-роксидаз, тирозиназ и повышением активности каталаз. При последующей регидратации активность пероксидаз и тирозиназ повышается. Охарактеризованы кинетические особенности пероксидаз и тирозиназ и изоферментный состав пероксидаз из различных фракций белков клеточной стенки антоцероса. Показано, что пероксидазы антоцероса по своей функциональной активности, в том числе способности к образованию супероксидного анион-радикала, имеют сходство с пероксидазами высших сосудистых растений. Выявлен биохимический механизм, подтверждающий возможное участие пероксидаз в образовании активных форм кислорода (АФК) посредством субстрат-субстратного взаимодействия в талломе антоцероса. Предполагается, что образование АФК пероксидазами — эволюционно древний процесс, возникший как защитный механизм с целью повышения адаптационных механизмов наземного существования высших растений, их приспособления к меняющимся условиям среды и успешной колонизации различных экологических ниш.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: антоцерос, пероксидаза, супероксид, каталаза, тирозиназа, обезвоживание, регидра-тация.
Антоцеротовидные (АпШосего1:орку1а) — одни из древнейших наземных растений, появившиеся около 450 млн лет назад и насчитывающие по разным источникам от 200 до 300 видов
[1]. До недавнего времени антоцеротовидных рассматривали как один из классов моховидных
[2], однако в настоящее время они выделены в самостоятельный отдел в систематике растений [3, 4]. Благодаря своему цитологическому и морфологическому сходству как с водорослями,
Принятые сокращения: О2 — супероксидный анион-радикал, XTT — 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфо-фенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилид, АФК — активные формы кислорода, БПИ — буфер постинфильтрацион-ный, ДОФА — 3,4-дигидроксифенилаланин, КС — клеточная стенка, СОД — супероксиддисмутаза, ЭКР — экстраклеточный раствор.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 15-017, 21.06.2015.
** Адресат для корреспонденции.
так и с высшими растениями антоцеротовидные стали объектом пристального внимания молекулярных биологов и генетиков [3, 5]. Например, антоцеротовидные имеют характерный для водорослей хлоропласт с центральным пиреноидом, содержащим рибулозобисфосфаткарбок-силазу, поэтому обладают уникальным для наземных растений механизмом усвоения углерода [1]. В отличие от печеночников, где только в четырех родах (из более чем 340) обнаруживается симбиоз с сине-зелеными водорослями, у ан-тоцеротовидных он обнаруживается у представителей всех 14 родов [1, 6]. С практической точки зрения, антоцеротовидные изучаются как источники розмариновой кислоты или других биологически активных веществ [2]. Филогенетический и структурный анализы позволяют предположить, что в эволюционном плане анто-церотовидные являются сестринской группой для современных сосудистых растений [3, 5]. Вероятно, древние антоцеротовидноподобные
явились промежуточным звеном при переходе от организмов, где в жизненном цикле доминирует поколение с гаплоидным гаметофитом, к организмам с диплоидным спорофитом [5].
Большинство антоцеротовидных является обитателями нарушенных и незадернованных местообитаний, выступая пионерами при заселении обнаженной влажной почвы. В то же время известно, что антоцеротовидные являются чрезвычайно засухоустойчивыми. В отличие от вегетативных органов высших сосудистых растений, являющихся чрезвычайно чувствительными к обезвоживанию, таллом антоцероса обладает феноменальной особенностью сохранять жизнеспособность при потере 95% воды [7, 8]. Благодаря своей высокой устойчивости к действию неблагоприятных факторов среды, антоцеротовидные представляют собой уникальную модель для изучения механизмов формирования устойчивости высших растений. Несмотря на очевидную важность, биохимические механизмы устойчивости, в том числе кинетические характеристики окислительно-восстановительных реакций, в растениях остаются предметом дискуссий. В частности, острым вопросом является выявление двойственной роли пероксидаз и переключение режимов функционирования с антиоксидантного на прооксидант-ный. В клетках сосудистых растений, например, в корнях пшеницы, одними из ключевых ферментов редокс-метаболизма при стрессе являются апопластные пероксидазы, обладающие способностью как к разложению Н2О2, так и образованию активных форм кислорода (АФК) [9, 10]. Эта многофункциональность пероксидаз, а также множественность изоформ и кодирующих их генов детерминируют важную роль пе-роксидаз в формировании устойчивости растений. Несмотря на интенсивное изучение химизма реакций и эволюции структуры пероксидаз [11—13], возможные механизмы и факторы, способствующие стимулированию АФК-образую-щей активности пероксидазы, остаются неразрешенными. Перспективным приемом решения этой проблемы может стать изучение неизвестных до настоящего времени особенностей функционирования пероксидаз антоцеротовидных, стоящих на более низкой в сравнении с сосудистыми растениями эволюционной ступени.
При стрессе в клетках бриофитов так же, как и у большинства растений, может происходить повышение уровня АФК. Ранее нами впервые было показано, что ряд лишайников, мхов, а также печеночник и антоцерос обладают высокой редокс-активностью, в частности, по образованию супероксидных анион-радикалов (О2Г) [8]. Примечательно, что самая высокая актив-
ность наблюдалась именно в талломе АШкосегов пМактя 8. Несмотря на очевидную важность, биохимические механизмы устойчивости, опосредованные окислительно-восстановительны -ми ферментами, в том числе пероксидазами, в клетках антоцеротовидных практически не изучены. В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования был анализ кинетических характеристик редокс-ферментов антоцеротовидных. Особое внимание было уделено изучению изменений активности пероксидаз при стрессе, индуцированном обезвоживанием и последующей регидратацией таллома антоцеро-са, а также возможного участия пероксидаз в образовании АФК.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования, приготовление образцов для измерения ферментативной активности. Эксперименты проводили на талломе АШкосегоз natalensis 8., собранном в Ботаническом саду Университета КваЗулу-Натал, ЮАР. В экспериментах по изучению активности редокс-фер-ментов в стрессовых условиях таллом антоцеро-са подвергали обезвоживанию с последующей регидратацией [8, 14]. Образцы таллома (содержание воды — 30 г Н2О на 1 г сухой массы) навеской 0,5 г помещали в стаканчики для взвешивания. Обезвоживание таллома проводили в эксикаторе путем выдерживания образцов над насыщенным раствором СаС12 от 0 до 68 ч. Взвешивание материала для расчета относительного содержания воды (ОСВ) в талломе осуществляли в следующие интервалы: 2,5, 20, 23,5, 24, 44, 48, 67, 68 ч. Для определения ферментативной активности отбор материала проводили через 24, 48 и 68 ч. Дальнейшую регидратацию таллома после обезвоживания выполняли в дистиллированной Н20 в течение 1 и 3 ч. Анализ активности окислительно-восстановительных ферментов был проведен во внутриклеточной фракции и экстраклеточном растворе (ЭКР). После регидратации таллома антоцероса в дистиллированной Н20 таллом гомогенизировали в 5 мл 0,05 М фосфатного буфера Соренсена (№2НР04/ /КН2Р04), рН 7,0, центрифугировали при 4300 g 15 мин при 5°, определение внутриклеточной ферментативной активности проводили в супернанте. Раствор, в котором осуществляли регидратацию таллома (ЭКР), использовали для исследования экстраклеточной ферментативной активности.
Для изучения редокс-активности внутри клеток и в апопласте таллома антоцероса в зависимости от степени связывания ферментов со
структурными элементами клеточной стенки (КС) анализ активности окислительно-восстановительных ферментов был проведен во внутриклеточной растворимой фракции и фракциях белков КС. С этой целью белки из таллома анто-цероса экстрагировали, последовательно используя: Tris-HCl-буфер, фосфатный буфер Со-ренсена, дигитонин и NaCl [15]. В результате получали: внутриклеточную растворимую фракцию (C) и фракции белков, связанных с КС: B1 — водородными связями, B2 — ван-дер-ваальсовы-ми силами и гидрофобными взаимодействиями, B3 — ионными связями.
Для сравнения спектральных характеристик окисления субстратов пероксидаз антоцероса и корней пшеницы использовали буфер постин-фильтрационный (БПИ) корней пшеницы, содержащий апопластные пероксидазы. Для этого проводили вакуумную инфильтрацию отсеченных корней пятидневных проростков яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Казанская юбилейная в 0,1 М Na-цитратном буфере, pH 7,0 [16].
Определение активности окислительно-восстановительных ферментов. Активность перечисленных ниже ферментов определяли спект-рофотометрически по образованию соответствующего продукта или расходованию соответствующего субстрата на спектрофотометре Lambda 25 («Perkin Elmer», США) и выражали в нмоль/(с х г сухой массы). Во всех случаях реакцию
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.