АГРОХИМИЯ, 2015, № 10, с. 63-70
Экотоксикология
УДК 581.1577.152.193:58.071:633.491
АКТИВНОСТЬ ПЕРОКСИДАЗЫ В ФИТОПАТОГЕННОЙ СИСТЕМЕ
КОЛЬЦЕВАЯ ГНИЛЬ-ВЕГЕТИРУЮЩИЙ КАРТОФЕЛЬ ПРИ ВЛИЯНИИ МОНОЙОДАЦЕТАТА НАТРИЯ И ПРОГРЕВАНИЯ*
© 2015 г. А.И. Перфильева, Е.В. Рымарева, Е.Г. Рихванов, М.А. Живетьев, И.А. Граскова
Сибирский институт физиологии и биохимии растений 604033 Иркутск, ул. Лермонтова, 132, Россия E-mail: alla.light@mail.ru
Поступила в редакцию 01.04.2015 г.
Изучали изменение активности гваякол-зависимой пероксидазы у 2-х сортов картофеля (Solanum tuberosum L.), различающихся по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms). Клубни картофеля заражали Cms, а также обрабатывали мо-нойодацетатом натрия (МИА) и прогревали при 45оС. Активность пероксидазы анализировали в листьях растений на стадии бутонизации и цветения. Показана зависимость между устойчивостью к патогену и активацией пероксидазы. У устойчивого сорта картофеля активность пероксидазы возрастала при переходе к фазе цветения и при инфицировании патогеном. Этого не происходило у восприимчивого сорта. В то же время предпосадочная обработка клубней прогреванием и МИА ингибировала повышение активности пероксидазы. Полученные данные указывали, что МИА и прогревание могут оказывать длительный физиологический эффект на растения картофеля.
Ключевые слова: пероксидаза, кольцевая гниль, вегетирующий картофель, монойодацетат натрия, прогревание.
ВВЕДЕНИЕ
У растений в ответ на поражение патогенами развивается защитная реакция, которая выражается в активации экспрессии генов, кодирующих белки, связанные с патогенезом (pathogenesis-related proteins, или PR-белки). В число PR-бел-ков растений входит большое мультигенное семейство - пероксидазы класса III (КФ 1.11.1.7, Prxs) [1]. В растениях арабидопсиса функционирует более 73 генов, кодирующих Prxs, в рисе таких генов насчитывается 138 [2, 3]. Повышение активности Prxs и активация экспрессии генов, кодирующих эти ферменты, приводят к развитию устойчивости растений к широкому классу патогенов [3, 4]. Подавление экспрессии генов Prxs, наоборот, повышает восприимчивость растений к патогенам [4]. Проникновение патогена в растение усиливает продукцию активных форм кислорода (АФК) [4, 5]. Пероксидазы класса III либо нейтрализуют АФК, либо, напротив, индуцируют
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ-Сибирь, грант № 14-44-04107.
их образование [2, 6]. При поражении патогенами активация Prxs приводит к усилению генерации АФК [7, 8]. Повышение уровня АФК может непосредственно нейтрализовать патоген, а также способствовать лигнификации клеточной стенки, что предотвращает проникновение патогена или приводит к развитию реакции сверхчувствительности, ограничивающей распространение патогена по растению [4, 5].
Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms) - грамположительная бактерия, вызывает заболевание кольцевая гниль картофеля, проявляющееся в виде вилта стеблей и пожелтения листьев [9]. Кольцевая гниль является наиболее опасным заболеванием картофеля. По оценкам Европейской и Средиземноморской организации защиты растений (European and Mediterranean Plant Protection Organization, EPPO), потери урожая картофеля в России от заболевания кольцевой гнилью достигали 47% [10]. С использованием культуры картофеля in vitro в лабораторных условиях было показано, что у растений устойчивого сорта Луговской происходило значительное повышение активности пероксидазы после заражения
Cms [11]. Повышение активности пероксидазы при заражении картофеля кольцевой гнилью соответствует современным представлениям о роли Prxs в ответе растений на заражение [2-4]. Однако эффект Cms на активность пероксидазы у ве-гетирующих растений картофеля не был изучен. Имеются результаты, полученные с использованием патогена томата Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis (Cmm) [12], о влиянии на активность Prxs. Патогенные бактерии Cmm и Cms являются подвидами C. michiganensis и используют одни и те же факторы вирулентности [9]. Заражение Cmm повышало количество PR-белков в томатах; удивительно, что при этом синтез Prxs, наоборот, подавлялся [12].
Экспрессия генов Prxs и активность этих ферментов изменяется не только при поражении растений патогенами, но и при абиотическом воздействии, а также в ходе нормального роста и развития растений [3, 13]. Показано, что у араби-допсиса повышение активности пероксидазы наблюдают во время цветения, что, как полагают [3], связано с активацией защитных механизмов. Однако отсутствует информация о том, как изменяется активность Prxs у картофеля при переходе от фазы бутонизации к фазе цветения. Несмотря на обширность литературы о роли пероксидаз в стрессовых ответах растений, настоящая тема до сих пор является дискуссионной. Это обусловлено как верса-тильностью пероксидаз, так и множественностью их изоформ и широкой субстратной специфичностью. Следовательно, актуальность исследований в этом направлении представляется очевидной.
Несмотря на значительный ущерб, наносимый кольцевой гнилью, на сегодняшний день не существует доступных и эффективных способов борьбы с Cms, а также с другими бактериальными болезнями картофеля [9, 10]. Более того, использование устойчивых сортов картофеля, например с повышенной активностью Prxs, не рекомендуется, поскольку это приводит к скрытому распространению инфекции [9]. В этой связи представляется актуальным поиск способа борьбы с Cms. Потенциальным агентом для борьбы с Cms является монойодацетат натрия (МИА), ингибитор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы [14]. Ранее авторами было показано, что МИА имеет значительный фунгицидный и бактерицидный эффект [15], не оказывает отрицательного действия на продуктивность картофеля и, более того, способен ее повышать [16]. МИА отличается низкой стабильностью. При нагревании он быстро разлагается на йод и уксусную кислоту [14]. Следует отметить, что бактерицидное действие МИА при повыше-
нии температуры значительно возрастает [15]. Эти обстоятельства дали основания считать, что данный агент окажется не только эффективным средством борьбы с кольцевой гнилью, но и экологически безопасным. Авторы предположили, что в сочетании с тепловым воздействием МИА будет обладать более сильным бактерицидным эффектом и быстро разлагаться на безвредные соединения. Поскольку активность Prxs можно рассматривать как показатель стрессового состояния растений [3, 4], целью работы являлось изучение эффекта МИА и прогревания на активность этого фермента в процессе развития картофеля. Для этого решали следующие задачи: 1) впервые исследовать влияние заражения Cms на активность пероксидазы у вегетирующих растений картофеля; 2) изучить изменение активности пероксидазы в растениях картофеля при переходе от фазы бутонизации к фазе цветения; 3) определить, как обработка МИА и прогревание клубней влияют на активность пероксидазы в фазе цветения. Для решения задач сравнивали активность гваякол-зависимой пероксидазы устойчивого (Луговской) и восприимчивого (Лукьяновский) сортов картофеля.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования были 2 сорта картофеля Solanum tuberosum L.: сорт Луговской - устойчивый, сорт Лукьяновский - восприимчивый к ряду патогенов, в том числе к кольцевой гнили [17, 18]. Посадочный материал был получен из НИИ сельского хозяйства (п. Пивовариха, Иркутская обл., Российская Федерация). В исследованиях использовали штамм Ac 14 05 возбудителя кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, Cms (получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов, г. Пущино, Московская обл.). Бактериальную культуру выращивали в темноте при 26оС на качалке (80 об./мин) в колбах, содержащих жидкую питательную среду следующего состава: диализат дрожжевого экстракта, 10 г/л ("Реахим", Россия); глюкоза, 5 г/л ("Реахим", Россия); NaCl/л, 5 г ("Реахим", Россия); пептон, 5 г/л ("Реахим", Россия); рН 7.2. Для экспериментов с клубнями использовали 2-суточную культуру Cms в логарифмической фазе роста.
Полевой эксперимент. Для полевого эксперимента картофель перед посадкой подвергали обработке МИА ("Sigma", США) следующим образом: клубни окунали в водный раствор 1 мМ МИА, вынимали, обсушивали. Контрольные образцы замачивали в дистиллированной воде.
Клубни прогревали в воздушном термостате при температурах 26оС, 45оС в течение 1 ч. Сразу после обработки семенной материал всех вариантов высаживали в почву на поле экспериментального участка СИФИБР. В каждом варианте было по 10 растений. Длительность эксперимента - 90 сут.
Вегетационный эксперимент. Cms является патогенным организмом [9], поэтому для предотвращения заражения почвы эксперименты с инфицированными клубнями проводили в вегетационных сосудах Митчерлиха вместимостью 10 л, наполненных почвой. Клубни картофеля за 2 нед до посадки инфицировали путем инъекции инокулята культуры возбудителя Cms (титр 2 • 109 кл./мл) инсулиновым шприцом. Раневой участок заливали воском. В контрольные клубни вводили стерильную дистиллированную воду. Затем контрольные и зараженные клубни подвергали прогреванию в воздушном термостате при температурах 26оС или 45оС (1 ч). Далее клубни всех вариантов высаживали в сосуды. Эксперимент проводили в естественных климатических условиях на поле экспериментального участка СИФИБР. В каждом варианте было по 7-10 растений. В середине срока вегетации (45 сут) производили визуальную оценку наличия у растений симптомов заболевания (вилт, пожелтение листьев).
Определение активности пероксидазы. Активность растворимой гваякол-зависимой перок-сидазы измеряли в тканях листьев среднего яруса, собранных в фазах бутонизации и цветения (30-е, 45-е сут после посадки). Навески (1 г) листьев картофеля растирали в 10 мл охлажденного цитратно-фосфатного буфера рН 5.0-7.0. Полученный гомогенат центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин. Активность пероксидазы картофеля определяли в реакционной смеси следующего состава: 0.5 мл 0.1 М цитратно-фосфатного буфера, 0.5 мл 0.3%-ного пероксида водорода ("Реахим", Россия), 0.5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.