научная статья по теме АКТИВНОСТЬ СИСТЕМЫ ЦАМФ В ЛИМФОЦИТАХ И ТРОМБОЦИТАХ ОВЕЦ ПРИ ОБЩЕМ ВНЕШНЕМ ВОЗДЕЙСТВИИ -ИЗЛУЧЕНИЯ IN VIVO Биология

Текст научной статьи на тему «АКТИВНОСТЬ СИСТЕМЫ ЦАМФ В ЛИМФОЦИТАХ И ТРОМБОЦИТАХ ОВЕЦ ПРИ ОБЩЕМ ВНЕШНЕМ ВОЗДЕЙСТВИИ -ИЗЛУЧЕНИЯ IN VIVO»

= РАДИАЦИОННАЯ БИОХИМИЯ =

УДК 577.1:611.018.5:599.735.52:539.1.047

АКТИВНОСТЬ СИСТЕМЫ цАМФ В ЛИМФОЦИТАХ И ТРОМБОЦИТАХ ОВЕЦ ПРИ ОБЩЕМ ВНЕШНЕМ ВОЗДЕЙСТВИИ у-ИЗЛУЧЕНИЯ in vivo

© 2015 г. Т. С. Шевченко*, В. О. Кобялко

Всероссийский научно-исследовательский институт радиологии и агроэкологии, Обнинск

Методом тонкослойной хроматографии определяли базальную и стимулированную простагланди-ном Ej активности аденилатциклазы и активность фосфодиэстеразы, а содержание циклического АМФ (цАМФ) — с помощью радиоиммунологических наборов с 125J. Выявили модификацию активности системы цАМФ в исследуемых клеточных популяциях с 1-х сут после радиационного воздействия: базальная активность аденилатциклазы в лимфоцитах была повышена во все сроки исследования в 1.7—4.3 раза, а стимулированная — возрастала на 1-7-е сут в 2.1—8.8 раза. В тромбоцитах отмечали увеличение базальной активности аденилатциклазы на 1-е и 7-е сут в 2.7 и 3.5 раза соответственно, а стимулированной — в те же сроки в 6.9 и 5.7 раза. Коэффициент стимуляции аденилатциклазы в лимфоцитах повышался на 1-е и 5-е сут в 1.8 и 2.3 раза соответственно, на 7-е сут был на исходном уровне, а на 10—15-е сут уменьшался ниже контрольных значений. Величины данного показателя в тромбоцитах не имели достоверных отличий от исходных данных. Активность фосфодиэстеразы в лимфоцитах возрастала на 3-и сут в 3.0 раза, на 7-е сут — в 2.4 раза, а в тромбоцитах оставалась на уровне контрольных значений. Содержание цАМФ в лимфоцитах уменьшалось в первые 12 ч и на 3-и сут в 2.71 и 2.38 раза соответственно, тогда как в тромбоцитах — через 12 ч понижалось в 3.08 раза и на 3-и сут увеличивалось в 1.91 раза, не отличаясь в другие сроки от исходных значений. Делается предположение, что выявленная модификация активности системы цАМФ в лимфоцитах и тромбоцитах в разные сроки после облучения животных имеет в своей основе различные механизмы. В начальный период изменение активности ферментов системы цАМФ и содержания цАМФ обусловлено радиационным воздействием на цитоплазматические мембраны клеток, циркулирующих в периферической крови животных. В последующие сроки регистрируемые изменения определяются преобладанием в крови более устойчивой к лучевому повреждению субпопуляции клеток с повышенными активностью ферментов системы цАМФ и концентрацией цАМФ, соответствующими значениям у необлученных животных.

Внешнее у-излучение, лимфоциты, тромбоциты, базальная и стимулированная простагландином Е1 активности аденилатциклазы, активность фосфодиэстеразы, содержание цАМФ, овцы.

DOI: 10.7868/S0869803115030091

Внешнее воздействие у-излучения на организм млекопитающих в дозах 2—10 Гр вызывает поражение системы кроветворения, которое сопровождается гибелью радиочувствительных клеток костного мозга и периферической крови [1, 2]. В механизмах повреждения и гибели клеток особая роль принадлежит универсальным системам регуляции метаболизма, к которым относится и система цАМФ [3—5]. Ключевым звеном системы цАМФ является трансмембранный сигнальный каскад: адренорецептор — О-белок — аденилатциклаза, осуществляющий трансдукцию сигнала в клетку от первичных мессенджеров (гормонов, медиаторов и нейротрансмиттеров)

* Адресат для корреспонденции: 239032 Обнинск, Калужская обл., Киевское ш., 109 км, ФГБНУ ВНИИРАЭ; тел.: (48439) 6-48-02, (48439) 9-69-38; факс: (48439) 6-80-66; 9-69-88; е-шаП: riar@obninsk.org, 8ИеусИепко1а1уапа@уап-dex.ru.

[6, 7]. При передаче сигнала с рецептора на фермент, синтезирующий цАМФ — аденилатциклазу в зависимости от активации О^ или Огбелков, происходит либо стимулирование, либо ингиби-рование синтеза этого вторичного мессенджера (цАМФ) [8, 9]. Кроме того, на концентрацию цАМФ в клетке оказывает влияние фосфодиэсте-раза — фермент, гидролизующий этот циклический нуклеотид [3]. Изменение уровня цАМФ в клетке, в свою очередь, индуцирует ряд метаболических процессов, приводящих к формированию специфической ответной реакции [3, 10—12].

Экспериментально показано, что воздействие у-излучения в дозах от сублетальной до летальной приводит к изменению концентрации первичных мессенджеров (катехоламинов, кортикостерои-дов, серотонина и других биологически активных соединений) в тканях и периферической крови млекопитающих [13, 14]. Также обнаружены по-

страдиационные нарушения функционирования ферментов системы цАМФ в некоторых клеточных популяциях: печени, селезенки, головного мозга, слизистой оболочки кишечника крыс и кроликов при облучении животных в дозах 5— 10 Гр [15, 16]. Внешнее воздействие у-излучения в дозе 10 Гр через 6 ч вызывало одновременное увеличение концентрации цАМФ в печени и селезенке крыс [17]. В то же время в первые часы после подобного воздействия в дозе 6 Гр содержание цАМФ в лимфоидных клетках селезенки мышей линии НК оставалось практически неизменным, а через сутки падало. При этом базальная активность аденилатциклазы в клетках монотонно понижалась. У этих же животных в тимоцитах наблюдали фазный характер изменения содержания цАМФ [18]. После облучения крыс в дозе 7.5 Гр на 1—3-и сут было выявлено снижение концентрации цАМФ и увеличение содержания цГМФ в тимусе, селезенке и печени. Аналогичным образом изменялись активность аденилат-циклазы и гуанилатциклазы, тогда как активность фосфодиэстеразы повышалась только в начальный период после облучения животных [19].

Исследование содержания цАМФ в селезенке и тимусе баранов в начальные сроки после облучения их в дозах, вызывающих острую лучевую болезнь легкой и средней степеней тяжести, показало снижение концентрации этого циклического нуклеотида на 40% [20]. Изучение активности аденилатциклазы в лимфоцитах и тромбоцитах овец, подвергнутых внешнему воздействию у-излучения в дозах 2.0 и 3.0 Гр, выявило фазовый характер изменения ферментной активности [21], тогда как у крупного рогатого скота, облученного в дозе 3.5 Гр, было отмечено увеличение активности аденилатциклазы в лимфоцитах и снижение ее в тромбоцитах [22].

Неоднозначность направленности пострадиационного изменения содержания цАМФ и активности ферментов системы цАМФ у животных разных видов вызывает необходимость дополнительного исследования ее функционирования в радиочувствительных клетках овец.

Поэтому целью работы стала оценка активности системы цАМФ в лимфоцитах и тромбоцитах овец, подвергнутых общему внешнему воздействию у-излучения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Исследования проводили на 16 овцах цыгай-ской породы (бараны) живой массой 32.35 ± 0.08 кг, которых содержали в условиях вивария ВНИИРАЭ. Рацион был сбалансирован по основ-

ным питательным веществам согласно нормам Всероссийского НИИ животноводства.

Контролем служила группа из 8 овец, которых содержали в тех же условиях, что и опытных животных. Вторую группу животных, состоящую из 8 голов, подвергали общему внешнему воздействию у-излучения в дозе 4 Гр (ЛД50/30) при мощности дозы 1 Гр/ч на установке "ГУЖ-24" (источник излучения 137Cs с энергией у-квантов 0.67 МэВ) (Россия). Контроль за уровнем дозы и равномерностью облучения подопытных животных осуществляли дозиметром "VAJ-18" (Германия) со сферической ионизационной камерой "VAK-253" (Германия). Неравномерность у-поля не превышала ±15%.

Кровь животных отбирали из яремной вены до облучения и на 1-, 3-, 5-, 7-, 10- и 15-е сут после воздействия. Антикоагулянтом служил цитрат натрия в конечной концентрации 0.38%. Популяции тромбоцитов и лимфоцитов овец выделяли разработанным нами способом [23]. Изолированные клетки промывали два раза в растворе, содержащем NaCl; KCl; K2HPO4; MgCl2; глюкозу и ^2-(гидроксиэтил)пиперазин №-2-этансульфо-новую кислоту (145; 5; 0.5; 1; 3 и 10 ммоль/л соответственно), рН 7.4. Подсчет количества клеток в полученных суспензиях проводили под микроскопом в камере Горяева. Жизнеспособность выделенных клеток, определяемая с помощью окрашивания 0.1%-ным раствором трипанового синего, составляла 95%. Перед проведением ферментной реакции аликвоту тромбоцитов замораживали, а лимфоцитов — лизировали в гипотонической среде 30 мин при 4°С.

Данные определения активности основных ферментов системы цАМФ и содержания цАМФ в лимфоцитах и тромбоцитах всех 16 голов овец до начала эксперимента рассматривали как объединенный контроль (исходные данные).

Активность аденилатциклазы и фосфодиэсте-разы в лизатах клеток определяли в соответствии с условиями, описанными ранее [24]. В качестве меченых субстратов ферментных реакций использовали 14С-АТФ и 3Н-цАМФ ("Amersham", Великобритания). Разделение продуктов ферментных реакций проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинах "Силуфол УФ-254" (Чехия). Среда инкубации для анализа активности аденилатциклазы включала: АТФ; ГТФ; MgSO4; этиленгликоль-ди^-аминоэтило-вый эфир/^^-уксусной кислоты (ЭГТА); кре-атинфосфат; трис-HCl (0.5; 0.1; 10; 2; 5; 50 моль/л соответственно), 40 ед/мл креатинкиназы; 37 КБк 14С-АТФ (рН 7.4; t = 30°С).

Гормон-стимулированную активность аденилатциклазы определяли в присутствии 10-5 моль/л простагландина Е1 по разнице ферментной активности с активатором и без него, а коэффициент стимуляции аденилатциклазы — по отношению величин стимулированной и базальной компонент активности фермента. Простагландин Е1 был выбран в качестве эффектора в связи с тем, что, действуя на а-рецепторы аденилатциклазно-го комплекса в исследуемых типах клеток, он стимулирует фермент в отличие, к примеру, от изо-протеренола, который в лимфоцитах активирует аденилатциклазу, а в тромбоцитах — ингибирует ее [25].

Для оценки активности фосфодиэстеразы использовали среду инкубации, содержащую: 5-АМФ; цАМФ; MgCl2; HCl (3; 0.3; 15; 100 моль/л соответственно) и 2 КБк 3Н-цАМФ (рН 8.0; t =37°С).

Содержание цАМФ в клетках крови измеряли при помощи радиоиммунологических наборов с 125J ("Chemapol", Чехия).

Подсчет радиоактивности всех образцов проводили на жидкостно-сцинтилляционном счетчике "SL-4220" ("Intertechnique", Франция).

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием t-критерия Стью-дента и пакета программ Microsoft Excel 2003. Различия между контрольными и опытными значениями считали достове

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»