ОНТОГЕНЕЗ, 2008, том 39, № 5, с. 367-373
БИОХИМИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 591
АКТИВНОСТЬ СКЛОННОЙ К ОШИБКАМ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ЙОТА В РАЗНЫЕ ПЕРИОДЫ ОНТОГЕНЕЗА ДОМОВОЙ МЫШИ Mus musculus
© 2008 г. А. В. Макарова, Л. В. Генинг, И. В. Макарова, В. 3. Тарантул
Институт молекулярной генетики РАН 123182 Москва, пл. Академика Курчатова, д. 2 E-mail: amakarova-img@yandex.ru Поступила в редакцию 04.02.08 г. Окончательный вариант получен 14.02.08 г.
Анализ некорректной активности склонной к ошибкам ДНК-полимеразы йота в ходе онтогенеза M. musculus показал, что ее активность претерпевает значительные изменения, достигая полномасштабного проявления в большинстве органов при внутриутробном развитии организма и снижаясь во взрослом организме. Сделано предположение о том, что при развертывании быстроменяющейся генетической программы в эмбриогенезе млекопитающих важна способность склонных к ошибкам ДНК-полимераз осуществлять синтез в поврежденных участках ДНК, что позволяет снять блок репликации и предотвратить гибель клеток.
Ключевые слова: ДНК-полимераза йота, некорректная активность, повреждения ДНК, гипермутагенез.
ДНК живых организмов постоянно подвергаются повреждениям, возникающим под действием разнообразных химических и физических факторов. Иногда системы репарации не успевают ликвидировать повреждения до начала очередного раунда репликации. Однако в силу особенностей строения каталитического центра процес-сивные ДНК-полимеразы, обеспечивающие точную репликацию геномной ДНК, не способны вести синтез в поврежденных участках. Для того чтобы снять блок репликации и предотвратить гибель клеток, природа создала ДНК-полимеразы, имеющие более открытый и толерантный к структуре матрицы каталитический центр, способный осуществлять синтез в поврежденных участках: прокариотические Pol IV (DinB) и Pol V (UmuC), эукариотические Pol в, Pol Z, Pol n, Pol i, Pol к, Pol X, Pol | и REV1. В ряде случаев эти ферменты встраивают напротив повреждения нужный нуклеотид (error-free translesion DNA synthesis), восстанавливая исходную структуру ДНК. Однако эти ДНК-полимеразы неизбежно осуществляют высокоошибочный синтез при использовании в качестве матрицы неповрежденной ДНК, в результате чего частота ошибок возрастает до 10-1 - 10-3 (Johnson et al., 2000a, b; Matsuda et al., 2000; Ohashi et al., 2000; Tissier et al., 2000). За такое поведение эти ферменты были названы склонными к ошибкам (error-prone) ДНК-полимеразами.
Особое место среди склонных к ошибкам ДНК-полимераз занимает ДНК-полимераза йота
(Pol i). Благодаря особому строению каталитического центра и использованию не уотсон-криков-ского, а хугстиновского взаимодействия, Pol i человека обладает набором необычных свойств. Так, она способна выполнять некоторые функции, направленные на сохранение стабильности генома. Например, Pol i человека может удалять фосфат дезоксирибозы (дезоксирибофосфатли-азная активность), что необходимо для правильного восстановления поврежденного участка ДНК при эксцизионной репарации оснований (Bebenek et al., 2001). Pol i человека способна также встраивать напротив урацила гуанин, что может быть использовано клеткой для предотвращения транзиций, вызываемых дезаминировани-ем цитозина (Vaisman, Woodgate, 2001; Vaisman et al., 2006). Наконец, этот фермент способен вести синтез напротив целого ряда повреждений ДНК с различной эффективностью и степенью корректности (АП-сайты, разнообразные аддукты пури-новых оснований и др.).
В то же время Pol i человека обладает самой низкой точностью синтеза неповрежденной ДНК среди всех известных сегодня ДНК-полимераз (McDonald et al., 2001). При этом включение новых нуклеотидов напротив четырех оснований ДНК происходит с различной точностью и эффективностью. Напротив тимина матрицы фермент встраивает dGTP (дезоксигуанозинтрифосфат) (по тому же механизму, что и напротив урацила) в несколько раз эффективнее, чем канонический dATP (дезоксиаденозинтрифосфат) (Zhang et al., 2000).
Напротив пуринов матрицы Pol i осуществляет более точный и эффективный синтез, чем напротив пиримидинов (Johnson et al., 2000a; Tissier et al., 2000; Zhang et al., 2000; Washington et al., 2004).
Экспрессия многих генов является тканеспеци-фичной, и профиль экспрессии значительно изменяется в ходе онтогенеза. Известно, что мРНК Pol i присутствует во всех тканях человека, однако в разном количестве: наибольший ее уровень наблюдается в семенниках, заметное количество содержится в сердце и поджелудочной железе. В организме взрослых мышей максимальное количество мРНК Pol i также было отмечено в семенниках, незначительный уровень экспрессии имел место в легких, головном мозгу и селезенке (McDonald et al., 1999). мРНК Pol i была выделена из семенников (BC121199) и клеток гаструлы (DQ102380) Xeno-pus tropicalis, однако каких-либо серьезных попыток оценки экспрессии этого фермента в ходе онтогенеза на сегодняшний день не предпринималось.
Известно, что активность фермента является более полной характеристикой его экспрессии, чем количественное определение мРНК в клетках. Ранее мы предложили вариант метода тестирования биохимической активности Pol i в грубых экстрактах различных тканей и органов животных, основанный на уникальной способности этой ДНК-полимеразы эффективнее встраивать гуанин напротив тимина матрицы даже в условиях избытка в реакционной смеси dATP (Генинг и др., 2004, 2006а). Грубые экстракты клеток различных органов и тканей животных использовались в качестве ферментных препаратов при проведении ДНК-полимеразной реакции с меченым олигонуклеотидным субстратом. Этот метод был использован и в настоящей работе для анализа экспрессии Pol i в разные периоды онтогенеза домовой мыши.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объекты исследования. Тестирование некорректной активности Pol i в разные периоды онтогенеза проводили на грубых экстрактах органов и тканей домовой мыши Mus musculus. Возраст взрослых животных, использовавшихся для проведения эксперимента, составлял 3 мес, новорожденных - не более 16 ч с момента рождения. Эмбрионы мыши для проведения эксперимента извлекали на 15-й день внутриутробного развития.
Куриные зародыши Gallus domesticus использовали для проведения эксперимента на 10-й день эмбрионального развития. Оплодотворенные яйца были приобретены в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А.Тимирязева и инкубированы в воздушном термостате при 37°C.
Взрослых животных умерщвляли при помощи дислокации шейных позвонков, новорожденных и эмбрионы - путем декапитации.
Определение активности Pol l в клеточных экстрактах. Соответствующий извлеченный целый орган или участок ткани промывали охлажденным во льду буфером PBS; мМ (2 KH2PO4, 10 Na2HPO4 ■ 7 Н20, 137 NaCl, 2.7 KCl, pH 7.4), затем измельчали на льду в стеклянном гомогенизаторе с этим же буфером. Объем буфера для гомогенизации брался из расчета 1 мкл на 1 мг гомогенизируемой ткани. Полученный гомогенат центрифугировали при 4°С в течение 5 мин при 14000 g. Су-пернатант использовали в качестве ферментного препарата.
Для тестирования активности Pol i использовали два комплементарных олигонуклеотида, которые при гибридизации образуют дуплекс с выступающим 5'-концом: 5'-GGAAGAAGA-AG-TATGTT-3' и 3 '-CCTTCTTCT-TCATACAATCT-TACTTCTTCC-5' (Zhang et al., 2000).
Мечение с 5'-конца 17-членного олигонуклеотида осуществляли с помощью полинуклеотидки-назы фага T4 и [у-'^АТФ в киназном буфере; мМ (50 трис-HCl, 10 MgCl2, 5 ÑTT, 0.1 спермиди-на, 0.1 3ÑTA, рН 7.6) при 37°C в течение 30 мин. Субстрат для ферментативной реакции получали после отжига в 50 мкл 300 пмоль меченого 17-членного олигонуклеотида с 350 пмоль холодного 30-членного олигонуклеотида в киназном буфере с добавлением NaCl до 100 мМ. Отжиг проводили при 73°С в течение 3 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры.
Реакцию осуществляли в 20 мкл смеси, содержавшей по 1мМ dATP и dGTP, а также 60 пмоль субстрата в буфере Кленова; мМ (50 трис-HCl, 5 MgCl2, 1 ÑTT, pH 8.0). К реакционной смеси добавляли 5 мкл экстракта и инкубировали в течение 12 мин при 37°C. Реакцию останавливали охлаждением во льду с последующим добавлением равного объема смеси: 95% формамида; 50 мМ ЭДТА; 0.05% бромфенолового синего. Отрицательным контролем служила смесь с субстратом без добавления клеточного экстракта.
По 4 мл смеси использовали для разделения с помощью электрофореза в 18%-ном денатурирующем полиакриламидном геле (длина геля - 60 см, толщина - 0.3 мм) в буфере TBE; мМ (89 трис-HCl, 89 борной кислоты, 2 ЭДТА, рН 8) при напряжении 5000 В с подогревом геля до начала выхода из него бромфенолового синего. После электрофореза гель дважды выдерживали в фиксирующем растворе в течение 15 мин (10%-ная ледяная уксусная кислота и 30%-ный этанол), сушили на вакуумной сушке для гелей с подогревом в течение 1 ч и делали радиоавтографы с помощью экрана Storage Phosphor Screen ("Molecular Dynamics", США) в течение 16-24 ч. Автографы
сканировали затем на приборе PhosphorImager Storm 840 ("Amersham Bioscience", США).
Препарирование новорожденных животных и эмбрионов осуществляли на льду с использованием бинокуляра Stemi DV4 Zeiss, Германия. Для приготовления суммарного экстракта из определенного органа или ткани соответствующие образцы извлекали из 6-8 эмбрионов или новорожденных мышей и из одного куриного эмбриона.
После электрофоретического разделения продуктов реакции наличие активности Pol i определяли по присутствию двух радиоактивных полос, соответствующих двум встроенным напротив ти-мина субстрата 18-членным олигонуклеотидам с аденином или гуанином на З'-конце, которые характеризуются разной электрофоретической подвижностью. При этом более подвижная нижняя полоса отражала количество олигонуклеотида с З'-концевым dATP, а верхняя - количество менее подвижного специфического продукта синтеза Pol i, у которого в 18-м положении напротив ти-мина матрицы произошло включение dGTP.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее при исследовании ферментативной активности Pol i в организме млекопитающих мы показали, что наибольшая активность этой ДНК-полимеразы характерна для экстрактов семеннико
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.