ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 462, № 3, с. 363-365
^ ОБЩАЯ
БИОЛОГИЯ
УДК 574.43
АКТИВНОСТЬ УРЕАЛИТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОМ ТРАКТЕ ТЕТЕРЕВА-КОСАЧА Ьугыгт геМх © 2015 г. М. В. Вечерский, Т. А. Кузнецова, А. А. Степаньков
Представлено академиком РАН Ю.Ю. Дгебуадзе 04.12.2014 г. Поступило 30.12.2014 г.
БО1: 10.7868/8086956521515030Х
Азот — важный элемент питания животных. Корма, потребляемые травоядными животными, как правило, дефицитны по содержанию как белкового, так и небелкового азота. Поэтому для строгих фитофагов, потребляющих относительно бедные этим элементом корма, особенно актуальна минимизация потерь азота, происходящих в результате дезаминирования аминокислот и азотистых оснований.
Одним из путей сохранения диетарного азота в организме фитофагов является рециклизация мочевины. На примере сельскохозяйственных животных показано, что мочевина из крови поступает в желудочно-кишечный тракт и там усваивается микроорганизмами, которые, в свою очередь, подвергаются лизису и служат полноценным источником белка для организма хозяина [1].
Наиболее распространенным количественным показателем интенсивности рециклизации азота является активность уреазы, одинаково хорошо характеризующая темп рециклизации мочевины и мочевой кислоты: мочевая кислота сначала гидролизуется до мочевины, которая затем подвергается воздействию уреазы. Известно, что у жвачных животных рециклизация мочевины протекает в рубце [2, 3]. Предполагается, что у нежвачных животных и птиц усвоение мочевины происходит в слепой кишке, как, например, у домашних свиней и кур. Среди птиц-фитофагов вместительной слепой кишкой, длина которой достигает 40—45% длины всего кишечника, выделяется тетерев-косач. Отметим, что у домашних кур слепая кишка составляет лишь около 25% [4].
Целью данной работы были изучение активности и видового состава уреалитического звена мик-робиома желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) тете-
Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской Академии наук, Москва E-mail: vecherskomy@mail.ru, tashka_u@mail.ru
рева-косача и оценка его способности реутилизи-ровать диетарный азот.
Объектами исследования послужили образцы содержимого ЖКТ 9 взрослых особей тетерева-косача, добытых путем лицензионного отстрела в охотхозяйствах Нижегородской области в период весенней (4 особи) и осенней (5 особей) охоты. Образцы химуса отобраны из зоба, желудка, двенадцатиперстной и тощей кишок, левой и правой частей слепой кишки и прямой кишки.
Активность уреазы (КФ 3.5.1.5.) определяли фотоколориметрически, используя модификацию классической методики [5]. Образец содержимого ЖКТ массой 0.1 г инкубировали в 10 мл 5% раствора мочевины в течение 1 ч при температуре 37°C. Далее суспензию центрифугировали 2 мин при 8000 об./мин, отбирали 1 мл суперна-танта, который разводили 4 мл дистиллированной воды. К полученному раствору добавляли 100 мкл 50% раствора тартрата калия-натрия и 100 мкл раствора Несслера. Светопоглощение полученного окрашенного раствора определяли с помощью фотоколориметра КФК-2 (Загорский оптико-механический завод, Россия) с синим светофильтром (длина волны 450 нм). Результаты представляли в виде массы азота аммиака, образующегося за 1 ч в 1 г влажного содержимого кишечника.
Содержимое слепой кишки каждой птицы высевали на питательные среды с разными источниками углерода и азота: Эшби, Эндо и ГПД ("Sigma", США). Также использовали модифицированную среду Эшби с карбоксиметилцеллюлозой в качестве основного углевода. Инкубацию проводили при температуре 37°C в течение 3 сут. Идентификацию выделенных микроорганизмов осуществляли методом секвенирования нуклео-тидных последовательностей участка гена 16S рРНК. Экстракцию ДНК проводили с помощью набора PowerFecal® DNA Isolation Kit ("MO BIO Laboratories", США), амплификацию ДНК выполняли в соответствии с протоколом Суходоль-ского [6] с использованием праймеров Bact-27F и
364
ВЕЧЕРСКИЙ и др.
Таблица 1. Уреазная активность (M ± m, n = 9) в разных отделах ЖКТ тетерева-косача
Отдел ЖКТ Уреазная активность, мг N-NH^/f ■ ч
весна осень
Зоб 0 0
Желудок 0.10 ± 0.04 0.12 ± 0.03
Двенадцати- 0.08 ± 0.04 0.10 ± 0.06
перстная кишка
Тощая кишка 1.31 ± 0.66 0.92 ± 0.49
Слепая кишка 30.2 ± 5.36 14.21 ± 3.44
Прямая кишка 15.6 ± 11.53 10.6 ± 9.48
Bact-683R набора Master Mix ("Fermentas", США) на термоциклере Mastercycler ("Eppendorf", Германия). Секвенирование ампликонов выполнено компанией "Синтол" (Россия). Анализ секвени-рованных последовательностей проводили с помощью электронной базы PubMed по алгоритму BLAST2. Об уреазной активности микроорганизмов судили по степени подщелачивания агара Кристенсена [7] в течение первых суток инкубации.
Статистическую обработку полученных экспериментальных данных осуществляли с помощью программы Statistica 8.0, результаты представляли в виде M ± m. Достоверность различий определяли с помощью непараметрического критерия Краскела—Уоллиса, достоверными считали различия приp < 0.05.
Уреазная активность была обнаружена во всех отделах ЖКТ тетерева кроме зоба (табл. 1). Максимальных значений она достигала в слепой кишке (до 41.3 мг N-N^/г • ч) — основном месте микробной ферментации тетеревиных. Достоверных различий между значениями в левой и правой частях слепой кишки не обнаружено (p > 0.05). В тонком кишечнике и желудке уреазная активность была на полтора-два порядка ниже, чем в слепой кишке (табл. 1). При этом в тощей кишке значения оказались достоверно выше, чем в двенадцатиперстной кишке (p = 0.012). Активность уреазы в тощей кишке (порядка 1 мг N-NH/г • ч) у тетерева сопоставима с максимальной активностью этого фермента в слепой кишке у нежвачных животных [8, 9]. Ранее было показано, что и другие бактериальные процессы, такие как азотфик-сация и расщепление структурных углеводов, активно протекают в тощей кишке тетеревиных [10]. Это позволяет предположить, что дисталь-ная часть тонкого кишечника принимает на себя функцию дополнительного микробного ферментера. Значения ферментной активности в прямой кишке сильно варьировались. Вероятно, это связано с особенностями моторики кишечника:
транзитный химус из тонкого кишечника имел низкие значения уреазной активности, в то время как химус слепой кишки характеризовался высокой активностью. Кроме того, была обнаружена сезонная динамика уреазной активности. Весной были выявлены более высокие значения активности для тощей, слепой и прямой кишок, чем осенью. Однако сезонные различия были статистически достоверны только для слепой кишки (p = 0.01). Вероятно, это связано со спецификой весеннего кормового рациона, стимулирующего более активную реутилизацию азота.
Выявленный нами уровень уреазной активности в тонком и толстом кишечнике у тетерева существенно превосходит этот показатель у других животных — кроликов, кур, свиней, у которых уровень её активности в слепой кишке не превышал 0.5 мг N-NH3/f • ч [8, 9]. По всей вероятности, это связано с большим дефицитом диетарно-го азота у тетеревиных птиц. Высокая активность рециклизации мочевины у тетеревиных обеспечивается особенностями функционирования их пищеварительной системы. Если у млекопитающих мочевина может попадать в ЖКТ из крови, то у птиц продукты обмена азота напрямую попадают из клоаки в слепую кишку благодаря обратной перистальтике, что приводит к периодическим скачкообразным повышениям концентрации мочевой кислоты. Сопоставимый уровень уреазной активности в ЖКТ обнаружен только у сельскохозяйственных жвачных — коров и овец, в рубце которых этот показатель в зависимости от условий может достигать 30 мг N-N^/г • ч [8, 11]. Для жвачных животных физиологическое значение рециклизации мочевины хорошо известно и широко используется на практике при подкормке рогатого скота мочевиной. Известно, что микроорганизмы, лишенные источника мочевины, быстро теряют уреазную активность [12]. Это подтверждает достаточную обеспеченность кишечного микробиома мочевиной. Поэтому полученные данные можно с известной осторожностью применять для оценки масштабов рецикли-зации азота. При активности уреазы в слепой кишке более 10 мг N-N^/г • ч тетерев-косач способен реутилизировать свыше одного грамма мочевой кислоты в сутки, что сопоставимо с диетар-ным поступлением азота (при расчете из зимнего суточного рациона 110 г сухого вещества [13]). У родственного вида — белой куропатки — (хотя у нее и не измеряли непосредственно уреазную активность) была показана деградация мочевой кислоты в слепой кишке с последующим усвоением образовавшегося аммиака [14, 15].
В результате проведенного анализа микробио-ма тетерева-косача нами было установлено, что наиболее активными уреалитиками среди выделенных нами микроорганизмов были: Enterobacter hormaechei, Klebsiella oxytoca, Citrobacter freundii, Ace-
АКТИВНОСТЬ УРЕАЛИТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
365
1оЪас1ег ра81еипапт, Асте1оЪас1ег сакоасеИсш. Максимальной численности бактерии-уреалитики достигали на среде Эндо (4.5 ■ 106 КОЕ/г), составляя около 40% всех бактерий, выделенных на данной среде. На среде ГПД численность микроорганизмов с уреалитической активностью была меньше (3.6 ■ 104 КОЕ/г) и составляла менее 5% от общего числа выделенных микроорганизмов. Гидролиз мочевины осуществляют преимущественно кишечные микроорганизмы, т.е. высокая уреазная активность в ЖКТ тетерева достигается не за счет специфических уреалитиков, а благодаря формированию благоприятных условий для кишечных симбионтов и недостатку иных источников азота.
Таким образом, высокая уреазная активность микробиома тетерева-косача обеспечивается типично кишечными микроорганизмами и позволяет птицам значительно снизить потери азота с экскретами.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 12—04— 01284-а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Singer M. // Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 2003. V 134. № 4. P. 543-558.
2. Titgemeyer E., Spivey K., Parr S., Brake D., Jones M. // J. Anim. Sci. 2012. V. 90. № 10. P. 3515-3526.
3. Recktenwald E, Ross D., Fessenden S., Wall C., Van Amburgh M. // J. Dairy Sci. 2014. V.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.