УДК 571.27:632.4:632.938:633.11
АКТИВНОСТЬ ЗАЩИТНЫХ БЕЛКОВ В РАСТЕНИЯХ ПШЕНИЦЫ ПРИ ОБРАБОТКЕ ХИТООЛИГОСАХАРИДАМИ С РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНЬЮ АЦЕТИЛИРОВАНИЯ И ИНФИЦИРОВАНИИ Bipolaris sorokiniana
© 2014 г. Л. Г. Яруллина, Р. И. Касимова, А. Р. Ахатова
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа 450054
e-mail: yarullina@bk.ru Поступила в редакцию 16.02.2014 г.
Исследовано влияние хитоолигосахаридов (ХОС) с различной степенью ацетилирования (СА) на генерацию пероксида водорода (Н2О2), изменение уровня экспрессии генов патоген-индуцируемых (patho-genesis—related proteins, PR) белков (оксалатоксидазы AJ556991.1, пероксидазы TC 151917, хитиназы AB029935.1, ингибитора протеиназы EU 293132.1) в корнях пшеницы Triticum aestivum L., инокули-рованной возбудителем корневой гнили Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoenaker. Обнаружены различия в ответных реакциях растений на инфицирование при предобработке семян ХОС в зависимости от СА. Показано, что ХОС со СА 65% более эффективно индуцируют накопление Н2О2 и повышение транскрипционной активности генов PR-белков по сравнению с ХОС со СА 30%. Полученные данные свидетельствуют о важной роли СА в проявлении элиситорных свойств ХОС, в том числе, в присутствии Н2О2.
DOI: 10.7868/S0555109914050158
Одним из перспективных и экологически безопасных подходов к снижению повреждающего действия возбудителей грибных болезней на продуктивность сельскохозяйственных культур является применение в растениеводстве иммуномоду-ляторов, стимулирующих естественные защитные механизмы растительного организма. Однако для разработки технологии использования такого рода препаратов необходимы сведения о взаимосвязи биологической активности с их молекулярной структурой, поскольку вместо индукции защитного ответа может произойти его супрессия [1].
Обнаружено, что наиболее эффективными эли-ситорами являются полисахаридные компоненты клеточных стенок фитопатогенов, в частности производные хитина [2]. Особый интерес среди них представляют водорастворимые низкомолекулярные хитоолигосахариды (ХОС). Один из механизмов защитного действия ХОС включает активацию генов, регулирующих синтез патоген-инду-цируемых белков [3], в частности оксалатоксидаз [4] и хитиназ растений [5]. Кроме этого, ХОС могут оказывать влияние на процессы продукции активных форм кислорода (АФК), и прежде всего пероксида водорода (Н2О2) [3], который, в свою очередь, принимает участие в регуляции экспрессии генов стрессовых белков [6] и антиоксидант-ных ферментов [7]. Показано, что определенную роль в специфичности проявления биологической активности производных хитина играет степень ацетилирования биополимера [8]. Это подтверждается тем, что у патогенов обнаружены
ферменты, изменяющие степень его ацетилирования [9]. Учитывая, что стратегия защитного ответа растений определяется типом пищевой специализации патогена, важно изучить роль степени аце-тилирования (СА) ХОС в индукции защитного ответа растений в каждой конкретной патосистеме.
Возбудитель корневой гнили пшеницы — гриб В1ро1ап8 зотокШапа (8аее.) 8Иоепакег. является широко распространенным патогеном с некро-трофным типом питания, для которого сохранение жизнеспособности клеток растения-хозяина не имеет принципиального значения, так как он развиваются на отмерших тканях [10]. Представляет несомненный практический и научный интерес изучение возможности повышения устойчивости растений пшеницы к этому патогену с применением ХОС.
Цель работы — сравнительная оценка изменений содержания пероксида водорода, экспрессии генов оксалатоксидазы, анионной пероксидазы, хитиназы и ингибитора протеиназы после предпосевной обработки семян пшеницы ХОС с различной СА и последующего инфицирования В. зого-кЫапа.
МЕТОДИКА
Объект исследования. В качестве объекта исследования были использованы проростки пшеницы (ТгШсыш агзИуыт Ь., сорт Жница). Растения выращивали при 20—22°С с 16-часовым светопе-риодом и освещенностью 12—16 тыс. люкс (лам-
пы ЛД-4, ЛБ-40). Перед посевом семена стерилизовали 80%-ным этанолом (3 мин), промывали дистиллированной водой и проращивали в кюветах на вермикулите. Заражение пшеницы B. soro-kiniana вызывали путем полива основания стеблей 5-суточных проростков суспензией конидий гриба в воде, содержащей 106 спор/мл [11].
Растворы (1 мг/л) водорастворимых ХОС с молекулярной массой 5—7 кД и СА 30% и 65% (ЗАО "Сонат", Россия) использовали для полусухой обработки семян пшеницы (20 мкл/г). В качестве контроля были использованы необработанные здоровые и инфицированные растения.
Определение содержания H2O2. Корни проростков гомогенизировали в 0.025 M фосфатном буфере, pH 6.2, в соотношении 1 : 3, центрифугировали 20 мин при 10000 g на центрифуге фирмы "Eppendorf" (Германия). Супернатант использовали для определения содержания H2O2. Содержание Н2О2 оценивали по оптической плотности при 560 нм, которую измеряли на спектрофотометре Biospek-Mini фирмы "Shimadzu" (Япония) после окрашивания ксиленоловым оранжевым [12]. Реагент содержал 0.074% соли Mора в 5.81%-ной серной кислоте и 0.009% ксиленоло-вого оранжевого в 1.82%-ном сорбите (в соотношении 1 : 100).
Оценка экспрессионной активности генов окса-латоксидазы, анионной пероксидазы, хитиназы, ингибитора протеиназы. На 3, 6, и 9 сут после инфицирования оценивали экспрессионную активность генов оксалатоксидазы (ОО), анионной пе-роксидазы (АП), хитиназы и ингибитора протеиназы (ИП). Параллельно с определением экспрессии генов ОО и АП оценивали активность ферментов.
РНК из растений выделяли фенольно-детер-гентным методом [13]. Для получения кДНК на основе мРНК изучаемых образцов проводили реакцию обратной транскрипции с использованием M-MuLV обратной транскриптазы согласно протоколу фирмы ("Fermentas", Литва). Полимераз-ную цепную реакцию (ПЦР) проводили в ампли-фикаторе типа ТП4-ПЦР-01-"Терцик". После амплификации фрагменты ДНК фракционировали методом электрофореза в 1-2%-ном агарозном геле или 7%-ном ПААГ в электрофоретической камере S2 ("Хеликон", Россия). В качестве положительного контроля использовали ПЦР гена, кодирующего экспрессирующийся конститутивно ту-булин. С помощью программы "Primer Select" (DNAStar) были подобраны высокоспецифичные праймеры к генам ОО (AJ556991.1), АП (TC 151917), ИП (EU 293132.1) и хитиназы (AB029935.1) [14], фланкирующие фрагменты ДНК размером 410, 157, 106 и 121 п.н. соответственно. Экспериментальным путем были подобраны условия проведения ПЦР. Компьютерный анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей
проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы "DNASTAR, Inc" (США).
Активность оксалатоксидазы (КФ 1.2.3.4). Ци-
топлазматическую (легко растворимую) фракцию фермента выделяли с использованием 0.05 М сук-цинатного буфера, pH 3.8 (СБ). Для этого корни гомогенизировали в СБ, при соотношении массы навески листьев к объему СБ (1 : 3). Экстракт центрифугировали 20 мин при 12000 g ("Eppendorf", Германия). Реакционная смесь для определения активности ОО содержала 100 мкл СБ, 0.0025 М щавелевую кислоту ("Реахим", Россия), 50 мкл супернатанта, пероксидазу хрена ("ДиаэМ", Россия) в концентрации 15 ед./мл и 0.08%-ный хро-могенный субстрат о-фенилендиамин (ОФД) ("Реахим", Россия).
Активность пероксидазы (КФ 1.11.1.7). Для выделения цитоплазматической фракции перокси-дазы отрезки листьев гомогенизировали в 0.01 М ^-фосфатном буфере, рН 6.2 (ФБ). Отношение массы навески листьев к объему ФБ 1 : 3. Экстракт центрифугировали 25 мин при 12000 g на центрифуге 5415К ("Eppendorf", Германия). Су-пернатант использовали для анализа активности пероксидазы. Активность фермента определяли микрометодом в паншетах для иммунофермент-ного анализа по окислению 0.15%-ного ОФД в присутствии 0.0015% Н2О2 в 0.01 М ФБ.
Оптическую плотность окисленного ОФД при определении активности ОО и пероксидазы определяли при 490 нм на приборе для иммунофер-ментного анализа Benchmark Microplate Reader ("BioRad", США). За единицу активности фермента принимали количество окисленного субстрата, вызывающего увеличение единицы оптической плотности АЛ за 1 мин. Для сравнительного анализа активность выражали в отн. ед. на 1 мг сырой массы.
Статистическая обработка данных. Эксперименты проводили в не менее 3 биологических по-вторностях при анализе биохимических показателей и в не менее 15 повторностях при анализе экспрессии. Для статистической обработки результатов использовали компьютерные программы StatSoft (Statistica 6.0).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние ХОС с различной СА и инфицирования B. sorokiniana на содержание Н2О2 в корнях пшеницы. В результате включения многих неспецифических защитных реакций и, в первую очередь, генерации Н2О2 у растений развивается устойчивость к возбудителям грибных болезней. Как видно на рис. 1, концентрация Н2О2 в корнях пшеницы изменялась под влиянием предобработки ХОС и инфицирования B. sorokiniana. При этом предобработка семян ХОС со СА 30% приводила
70
3 60
о
2 50
« о
р
3
о
40 30 '20 10
Рис. 1. Содержание Н2О2 в корнях пшеницы при обработке ХОС и инфицировании B. sorokiniana через 72 ч после инокуляции.
1 — контроль, 2 — обработка ХОС со СА 30%, 3 — обработка ХОС со СА 65%, 4 — инфицирование B. sorokiniana, 5 — обработка ХОС со СА 30% + инфицирование, 6 — обработка ХОС со СА 65% + инфицирование. На рис. 1, 2 и 4 приведены средние значения и их стандартные ошибки. * — различия достоверны при р < 0.05 по отношению к неинфицированному контролю, ** — по отношению инфицированному контролю.
к снижению в 2 раза содержания Н2О2 в корнях неинфицированных растений по сравнению с контролем (рис. 1, 2), а предобработка ХОС со СА 65% не вызывала изменений в ее содержании (рис. 1, 3).
Инфицирование растений B. sorokiniana вызывало повышение уровня Н2О2 в корнях, что обычно происходит при воздействии патогенов на растения (рис. 1). При этом в корнях растений, предобра-ботанных ХОС со СА 65%, уровень накопления Н2О2 был выше на 20%, чем в инфицированном
контроле (рис. 1, 6). Обращает на себя внимание тот факт, что в корнях растений, инфицированных и предобработанных ХОС со
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.