МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 5, с. 713-715
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.8.083.18(571.54)
АКТИВНОСТИ 6-ФОСФОФРУКТОКИНАЗ И НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ПИРОФОСФАТАЗЫ У АЭРОБНЫХ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ
© 2008 г. А. П. Бесчастный*, О. Н. Розова*' **, В. Н. Хмеленина*, Ю. А. Троценко*' **' 1
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино **Пущинский государственный университет Поступила в редакцию 28.01.2008 г.
Классические радиоизотопные и энзимологи-ческие исследования Дж. Р. Квейла привели к открытию рибулозомонофосфатного (РМФ) цикла ассимиляции формальдегида у метанотро-фов и метилобактерий [1, 2]. Ключевые реакции РМФ-цикла, катализируемые 3-гексулозофосфат-синтазой (ГФС) и фосфо-3-гексулоизомеразой, образуют фруктозо-6-фосфат из формальдегида и ри-булозо-5-фосфата. Предполагалось, что дальнейшее фосфорилирование фруктозо-6-фосфата до фруктозо-1,6-бисфосфата осуществляет АТФ-зави-симая 6-фосфофруктокиназа (ФФК), хотя ее низкая активность (2-8 мЕ/мг белка) у метанотрофов ставила под сомнение значимость гликолитического пути распада фосфосахаров в РМФ-цикле. Обнаружение активности пирофосфат-зависимой 6-фосфо-фруктокиназы (ПФК) у трех видов метанотрофов, реализующих разные пути ассимиляции С1-соедине-ний, наряду с высокой внутриклеточной концентрацией неорганического пирофосфата (ФФн), стимулировало изучение роли ФФн, а также необходимость пересмотра сложившихся представлений об организации/регуляции РМФ-цикла у аэробных ме-тилотрофных бактерий различного таксономического положения [3]. В связи с этим в данной работе были определены активности ФФн- и АТФ-зависи-мых 6-фосфофруктокиназ и пирофосфатазы (ФФн-азы) у широкого спектра аэробных метанотрофов и метилобактерий, реализующих различные пути С1-ассимиляции.
В работе использовали штаммы облигатных метанотрофов и метилобактерий из коллекции ИБФМ РАН, выращенных до начала стационарной фазы, как описано ранее [3, 4]. Использовали также 12 ч культуру Escherichia coli К12, выращенную на жидкой среде с глюкозой. Клетки отделяли от среды центрифугированием, промывали 50 мМ фосфатным буфером (рН 7) и разрушали ИБФМ-прессом из замороженного состояния. Гомогена-ты клеток центрифугировали (12000 g, 20 мин), диализовали против указанного буфера, получая бесклеточные экстракты. Активности ПФК
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: trotsenko@ibpm.puschi-no.ru).
(КФ 2.7.1.90), ФФК (КФ 2.7.1.11) и неорганической пирофосфатазы (КФ 3.6.1.1) определяли, как описано ранее [4]. Приведенные данные представляют средние трех измерений.
Результаты определения активности ПФК, АТФ-ФФК и ФФн-азы у облигатных и факультативных метилобактерий представлены в таблице. Поскольку отмеченная активность ФФК могла быть обусловлена действием ПФК за счет примесей ФФн, в инкубационную смесь для определения ФФК вносили препарат неорганической пирофосфатазы дрожжей (0.2 Е/мл), в присутствии которой активность ФФК не обнаружена.
Наибольшая активность ПФК выявлена у I типа метанотрофов, ассимилирующих формальдегид в РМФ-цикле. У метанотрофов II типа с сериновым путем активность ПФК ниже, чем у метанотрофов I типа. Обратимость данной реакции и необходимость синтеза гексозофосфатов из триозофосфатов у метанотрофов II типа предполагают участие ПФК в глюконеогенезе этих бактерий. Наименьшие значения активности ПФК отмечены у X типа метанотрофов родов Methylococcus и Methylocaldum, реализующих одновременно три пути Сгассимиляции. Активность ФФн-азы в бесклеточных экстрактах метанотрофов значительно ниже, чем у большинства исследованных метилобактерий и E. coli К12.
Среди исследованных штаммов факультативных метилобактерий, использующих ФБФ-вариант РМФ-цикла, активность ПФК, наряду с низкими уровнями ФФн-азы и ФФК, отмечена только у Amy-colatopsis methanolica, что было показано ранее [4, 5]. Хотя ген pfk найден в геноме факультативного ме-тилотрофа Methylibium petroleiphilum, данные об активности ПФК отсутствуют [6]. У большинства исследованных метилобактерий не выявлены ПФК и ФФК, при этом активность ФФн-азы была высокой. Только Bacillus methanolicus M40 и M11, а также Pseudomonas esterophilus sp. 27RD при росте на Q-соединениях обладали высокими активностями ФФК (150-350 мЕ/мг) и ФФн-азы (1.5-2.5 Е/мг).
Таким образом, нами впервые установлено, что высокая активность ПФК сопровождается низкой активностью ФФн-азы и отсутствием ФФК у обли-
714
БЕСЧАСТНЫЙ и др.
Активности ФФН- и АТФ-зависимых 6-фосфофруктокиназ и неорганической пирофосфатазы у аэробных мети-лотрофных бактерий
MeTHTOTpo^ Источник углерода Путь С1-ассимиляции Активность (мЕ/мг белка)
ПФК ФФК ФФн-аза
Oö^nraTHMe MeTaHOTpo^M
Methylomonas methanica 12 CH4 РМФ (ФБФ + КДФГ) 750 0 40
Methylomonas methanica 68 BKM CH4 РМФ (ФБФ + КДФГ) 480 0 14
Methylobacter chroococcum 90 CH4 РМФ (ФБФ + КДФГ) 240 0 15
Methylosinus trichosporium OB3b CH4 Сериновый 110 0 60
Methylosinus trichosporium 44 CH4 Сериновый 200 0 40
Methylocystis echinoides 2 CH4 Сериновый 210 0 25
Methylococcus capsulatus Bath CH4 РМФ + РБФ + сериновый 86 0 20
Methylococcus capsulatus 874 CH4 РМФ + РБФ + сериновый 60 0 10
Methylocaldum szegedienze O-12 CH4 РМФ + РБФ + сериновый 10 0 н.о.
MeTMoöaKTepHH
Amycolatopsis methanolica CH3OH РМФ (ФБФ) 35 6 17
Mycobacterium methylovorum 915 CH3OH РМФ (ФБФ) 0 24 1500
Pseudomonas esterophilus 27 Метилацетат РМФ (ФБФ) 0 152 1700
Arthrobacter sp. 2B2 CH3OH РМФ (ФБФ) 0 0 120
Mycobacterium vaccae CH3OH РМФ (ФБФ) 0 0 320
Ancylobacter aquaticus Z 238 CH3OH РМФ (ФБФ) 0 0 870
Bacillus methanolicus M40 CH3OH РМФ (ФБФ) 0 200 2600
Bacillus methanolicus M11 CH3OH РМФ (ФБФ) 0 329 1500
Bacillus methanolicus PM6 ch3nh2 РМФ (ФБФ) 0 0 336
Arthrobacter globiformis ch3nh2 РМФ (ФБФ) 0 0 90
Arthrobacter globiformis Глюкоза РМФ (ФБФ) 0 0 320
Acidomonas methanolica CH3OH РМФ (ФБФ) 0 26 396
Methylophilus methylotrophus "H" CH3OH РМФ (КДФГ) 0 0 530
Methylophilus methylotrophus "B" CH3OH РМФ (КДФГ) 0 0 314
Methylophilus methylotrophus CH3OH РМФ (КДФГ) 0 0 443
Methylophaga marina BKM CH3OH РМФ (КДФГ) 0 0 660
Xanthobacter autotrophicum 32n CH3OH РБФ 0 0 280
Xanthobacter autotrophicum 25n CH3OH РБФ 0 0 200
Methylopila capsulata HM1 CH3OH Сериновый (ицл) 0 0 270
Aminobacter aminovorans ch3nh2 Сериновый (ицл+) 0 0 212
Hyphomicrobium zavarzinii ZV CH3OH Сериновый (ицл+) 0 0 50
Escherichia coli K12 Глюкоза 0 225 1200
Примечание. РБФ - рибулозо-1,5-бисфосфат, ФБФ - фруктозо-1,6-бисфосфат, КДФГ - 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат, н.о. - не определяли.
МИКРОБИОЛОГИЯ том 77 < 5 2008
АКТИВНОСТИ 6-ФОСФОФРУКТОКИНАЗ И НЕОРГАНИЧЕСКОЙ
715
гатных метанотрофов I, II и X типов, реализующих, соответственно, РМФ или сериновый пути Q-ме-таболизма или одновременно эти пути в сочетании с циклом Кальвина. Напротив, у метилобактерий разного таксономического положения, независимо от реализуемых путей Сгассимиляции, активность ФФн-азы выше, а ПФК отсутствует, за исключением факультативного метилотрофа A. methanolica. Следовательно, у всех метанотрофов, несмотря на фено- и генотипические отличия, существует связь между оксигенированием метана и наличием ПФК.
Недавно обнаружено, что в геноме Mc. capsulatus Bath [7] ген pfk находится в непосредственной близости к hpp гену мембранной ФФн-азы, имеющей достаточно высокую гомологию (60%) с Н+-трансло-цирующей ФФн-азой из Rhodospirillum rubrum [8]. Интересно, что наши предварительные данные указывают на их локализацию в одном опероне. Сопряженная экспрессия этих генов/ферментов свидетельствует о важной роли ФФн в метаболизме метанотрофов, но предстоит выяснить, имеет ли место синтез ФФн на мембранах (обеспечивая функционирование ПФК в прямой реакции), или, напротив, энергия ФФн, образующегося в обратной реакции, может быть трансформирована в энергию электрохимического потенциала с участием Н+-ФФн-азы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ström T, Ferenci T, Quayle JR. The carbon assimilation pathways of Methylococcus capsulatus, Pseudomonas methanica and Methylosinus trichosporium OB3B
during growth on methane // Biochem. J. 1974. V. 144. № 3. P. 465-472.
2. Quayle JR. The microbial assimilation of C1 compounds // The Thirteenth CIBA Medal Lecture. Biochem. Soc.Trans. 1980. V. 8. № 1. P. 1-10.
3. Trotsenko Y.A., Shishkina V.A. Studies on phosphate metabolism in obligate methylotrophs // FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 87. № 3-4. P. 267-271.
4. Хмеленина ВН., Цветкова М.Г., Бесчастный А.П, Троценко Ю.А. Особенности метаболизма метило-трофного актиномицета Amycolatopsis methanolica // Микробиология. 1997. Т. 66. № 3. С. 327-334.
5. Alves A.M.C.R, Euverink G.J.W., Santos H, Dijkhui-zen L. Different physiological roles of ATP-, PPi - dependent phosphofructokinase isoenzymes in methy-lotrophic actinomycete Amycolatopsis methanolica // J. Bacteriol. 2001. V. 183. № 24. P. 7231-7240.
6. Kane, SR., Chakicherla A.Y. , Chain P.S.G., Schmidt R., Shin M.W. , Legler T.C., Scow K.M. , Larimer F.W., Lucas S.M., Richardson P.M., Hristova K.R. Whole-genome analysis of the methyl tert-butyl ether-degrading beta-proteobacterium Methylibium petroleiphilum PM1 // J. Bacteriol. 2007. V. 189. P. 1931-1945.
7. Ward N., Larsen Q, Sakwa J., Bruseth L., et al, 38 coauthors. Genomic insights into methanotrophy: the complete genome sequence of Methylococcus capsulatus (Bath) // PLoS Biology. 2004. V. 2. P. 1616-1628.
8. Belogurov G.A., Turkina M.V., Penttinen A., Huopalah-ti S., Baykov A.A., Lahti R. H+-Pyrophosphatase of Rho-dospirillum rubrum. High yield expression in Escheri-chia coli and identification of the cys residues responsible for inactivation by mersalyl // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 22209-22214.
МИКРОБИОЛОГИЯ том 77 < 5 2008
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.