ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 6, с. 593-598
УДК 577.15:581.1
АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И ИОНЫ КАЛЬЦИЯ В РЕАЛИЗАЦИИ СТРЕСС-ПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ БРАССИНОСТЕРОИДОВ
НА РАСТИТЕЛЬНЫЕ КЛЕТКИ
© 2014 г. Ю. Е. Колупаев*, А. А. Вайнер*, Т. О. Ястреб*, А. И. Обозный*, В. А. Хрипач**
*Харьковский национальный аграрный университет им. В.В. Докучаева, Харьков 62483, Украина
e-mail: plant_biology@mail.ru **Институт биоорганической химии НАНБеларуси, Минск 220141, Беларусь e-mail: khripach@iboch.bas-net.by Поступила в редакцию 10.02.2014 г.
Исследовано влияние брассиностероидов — 24-эпибрассинолида и 24-эпикастастерона — на теплоустойчивость колеоптилей пшеницы (Triticum aestivum L.), генерацию ими супероксидного анион-радикала и активность антиоксидантных ферментов. Обработка колеоптилей 10 нМ растворами брассиностероидов вызывала транзиторное усиление генерации ими О2 и последующее увеличение активности супероксиддисмутазы и каталазы, а также повышение теплоустойчивости. Предобработка колеоптилей ингибитором НАДФН-оксидазы имидазолом снимала эффект усиления продукции супероксидного анион-радикала, препятствовала повышению активности антиоксидант-ных ферментов и развитию теплоустойчивости клеток. Действие брассиностероидов также угнетались после предварительной обработки отрезков колеоптилей хелатором внеклеточного кальция ЭГТА, и ингибитором АДФ-рибозилциклазы, никотинамидом. Обсуждается роль ионов кальция и активных форм кислорода, образующихся при участии НАДФН-оксидазы, при стресс-протекторном действии брассиностероидов на клетки колеоптилей пшеницы.
DOI: 10.7868/S0555109914060075
Брассиностероиды (БС) относятся к фитогор-монам, участвующим в ответе растений на абиотические и биотические стрессоры [1]. Известно, что устойчивость растений к неблагоприятным условиям среды повышается под действием экзогенных БС и их синтетических аналогов [2—6].
Было обнаружено повышение интенсивности биосинтеза белка в листьях пшеницы и мезокоти-лях кукурузы при обработке БС в условиях теплового [7] и холодового [8] стрессов. Недавно была показана индукция БС синтеза белков с шапе-ронными функциями [8]. Имеются сведения о повышении устойчивости проростков и взрослых растений пшеницы к солевому стрессу под влиянием 24-эпибрассинолида [9, 10].
Однако участие сигнальных посредников в реализации физиологических (в т.ч. стресс-протекторных) эффектов БС, остается недостаточно изученным. Показано, что оксид азота, активные формы кислорода (АФК) и MAP-киназный (mito-gen-activated protein kinase) каскад действуют при индуцировании БС реакций, необходимых для развития устойчивости к холоду и параквату [3, 11]. Экзогенный БС при посредничестве АФК индуцировал антиоксидантные ферменты в листьях огурца [3]. Есть основания полагать, что АФК, как сигнальные посредники, участвуют и в реализации стресс-протекторного действия БС на зла-
ковые растения. Было показано, что предобработка колеоптилей пшеницы БС вызывала транзиторное усиление генерации супероксидного анион-радикала и повышение содержания пе-роксида водорода в тканях с последующим развитием теплоустойчивости [12]. При этом антиок-сидант ионол, препятствовал положительному влиянию БС на теплоустойчивость растительных клеток.
Одним из важных ферментов, генерирующих АФК в клетках растений и животных, является НАДФН-оксидаза (КФ 1.6.3.1) [13]. Показано усиление экспрессии гена ЯБОН, кодирующего каталитическую субъединицу фермента, и повышение активности НАДФН-оксидазы у растений огурца под действием экзогенных БС [3, 6]. Известно, что активность НАДФН-оксидазы регулируется с помощью кальций-зависимых механизмов [13, 14]. Кальций, как универсальный вторичный мессенджер, участвует в реализации действия многих стрессовых фитогормонов [15, 16]. Показано усиление поступления ионов Са2+ в цитозоль растительных клеток через кальциевые каналы плазмалеммы под влиянием БС [17]. В то же время связь между АФК и кальцием как сигнальными посредниками при индуцировании БС устойчивости растений к стрессорам изучена недостаточно.
Цель работы — исследование роли ионов кальция и ферментных систем, генерирующих и обезвреживающих АФК, в развитии теплоустойчивости клеток колеоптилей пшеницы под действием природных БС.
МЕТОДИКА
В качестве объекта исследования использовали отрезки колеоптилей пшеницы (Triticum aesti-vum L.) сорта Элегия, которые отделяли от 4-суточ-ных этиолированных проростков, выращенных при температуре 20°С. В работе использовали 24-эпиб-рассинолид и 24-эпикастастерон, относящиеся соответственно к 7-оксалактонам и к 6-оксотипу БС и отличающиеся по биологической активности [18], которые были синтезированы в лаборатории химии стероидов Института биоорганической химии НАН Беларуси. В работе использовали также нитросиний тетразолий (НСТ) производства "Sigma" (США), НАДН - "Oriental yeast" (Япония), ЭГТА и тритон X-100 - "AppliChem GmbH" (Германия), никотинамид — "Shanghai synnad" (Китай), остальные реактивы квалификации ч. д. а. производства Украины или России.
Колеоптили инкубировали на простерилизо-ванном 2%-ном растворе сахарозы с добавлением Na-соли пенициллина (100000 ед./л, контроль). 24-эпибрассинолид и 24-эпикастастерон предварительно растворяли в этаноле (5 мг/50 мл) и вносили в среду инкубации колеоптилей (конечная концентрация 10 нМ). Эффективные концентрации БС, максимально повышающие теплоустойчивость колеоптилей пшеницы, были установлены ранее [12]. В вариантах без БС в инкубационную среду добавляли эквивалентное количество этанола. В качестве эффекторов в инкубационную среду добавляли имидазол (1 мкМ) (ингибитор НАДФН-оксидазы) [19], ЭГТА (50 мкМ) (хе-латор внеклеточного кальция) или никотинамид (1 мМ, антагонист образования циклической аде-нозин-5'-дифосфатрибозы, цАДФР) [20], или комбинации этих соединений с БС. Эффекторы вносили в среду инкубации колеоптилей за 3 ч до введения в нее БС.
После суточной инкубации колеоптилей в растворах исследуемых соединений часть отрезков подвергали потенциально летальному нагреванию в водяном ультратермостате в стерильной дистиллированной воде в течение 10 мин при 43 ± 0.1°С. Затем колеоптили помещали в чашки Петри со стерильным 2%-ным раствором сахарозы и пенициллина. Через 2 сут оценивали их повреждение по потере тургора и появлению специфического оттенка, обусловленного инфильтрацией тканей.
Генерацию супероксидных анион-радикалов интактными колеоптилями определяли по восстановлению НСТ по методике, описанной в ра-
боте [21]. Для проверки специфичности генерации
О2- использовали супероксиддисмутазу (СОД) (50 ед./мл), которая подавляла генерацию супероксидного анион-радикала. Количество генерированного О2- определяли по количеству восстановленного НСТ Супероксид-продуцирующую активность оценивали как изменение оптической плотности (^530) реакционной смеси при 530 нм за 1 ч инкубации в расчете на один отрезок колеопти-ля (7 мм). За 100% принимали значение оптической плотности в контроле.
Для определения активности СОД (КФ 1.15.1.1) и каталазы (КФ 1.11.16) растительный материал гомогенизировали в 0.15 М KjNa-фосфатном буфере, pH 7.6, содержащем ЭДТА (0.1 мМ), дитиотреитол (1 мМ), фенилметилсульфонилфторид (0.5 мМ) и тритон Х-100 (конечная концентрация 0.1%), при 2—4°С [22]. Для анализа использовали суперна-тант после центрифугирования гомогената при 8000 g в течение 10 мин при 4°С. Определение активности СОД основано на способности фермента конкурировать с НСТ за супероксидные анионы, образующиеся вследствие аэробного взаимодействия НАДН и феназинметасульфата [23]. Активность каталазы оценивали по количеству разложившегося пероксида водорода за единицу времени при рН 7.2 [24].
Содержание белка анализировали по методу Бредфорд, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин [25].
Эксперименты проводили независимо 3—4 раза с трехкратной биологической повторностью. Достоверность различий между вариантами оценивали по i-критерию Стьюдента (p < 0.05).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Обработка колеоптилей пшеницы 24-эпибрас-синолидом и 24-эпикастастероном вызывала повышение их выживаемости после повреждающего нагревания (таблица). Эффекты 24-эпибрассино-лида были несколько выше по сравнению с эффектами 24-эпикастастерона, однако различие в действии двух БС не было достоверным приp < 0.05.
Под влиянием 24-эпибрассинолида и 24-эпика-стастерона наблюдалось приблизительно одинаковое по величине транзиторное усиление генерации супероксидного анион-радикала колеоптилями пшеницы (рис. 1). Максимальный эффект отмечался через 2—5 ч после начала обработки БС, а через 24 ч образование О2- в вариантах с обоими БС снижалось. В связи с этим в дальнейших экспериментах генерацию супероксидного анион-радикала регистрировали через 2 и 5 ч после начала обработки колеоптилей БС.
Ингибитор НАДФН-оксидазы имидазол снижал образование О2- колеоптилями пшеницы (таб-
АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И ИОНЫ КАЛЬЦИЯ
595
Генерация супероксидного анион-радикала колеоптилями пшеницы через 2 и 5 ч после начала обработки БС, выживание их отрезков после повреждающего нагревания (43°С, 10 мин)
Вариант опыта Генерация супероксидного анион-радикала, % от контроля Выживание, %
2 ч 5 ч
Контроль 100.0 ± 3.8 104.2 ± 3.6 51.3 ± 1.9
24-эпибрассинолид (10 нМ) 139.2 ± 4.2 126.2 ± 3.9 68.1 ± 2.9
24-эпикастастерон (10 нМ) 135.3 ± 4.0 133.0 ± 3.7 64.4 ± 2.0
Имидазол (1 мкМ)* 89.6 ± 3.3 91.3 ± 2.9 46.8 ±2.6
24-эпибрассинолид (10 нМ) + имидазол (1 мкМ) 96.7 ± 3.9 94.6 ± 3.5 52.4 ± 2.5
24-эпикастастерон (10 нМ) + имидазол (1 мкМ) 102.2 ± 4.3 93.2 ± 2.6 54.2 ± 2.3
ЭГТА (50 мкМ)* 107.2 ± 5.1 104.7 ± 3.3 47.9 ± 2.9
24-эпибрассинолид (10 нМ) + ЭГТА (50 мкМ) 108.4 ± 3.7 110.0 ± 3.1 51.9 ± 2.6
24-эпикастастерон (10 нМ) + ЭГТА (50 мкМ) 108.9 ± 4.2 105.6 ± 2.8 49.0 ± 3.2
Никотинамид (1 мМ)* 112.4 ± 3.7 107.8 ± 3.6 50.8 ± 3.1
24-эпибрассинолид (10 нМ) + никотинамид (1 мМ) 119.4 ± 3.9 109.4 ± 4.2 49.0 ± 2.8
24-эпикастастерон (10 нМ) + никотинамид (1 мМ) 109.8 ± 4.2 107.0 ± 3.3 49.3 ± 3.0
* Имидазол, ЭГТА и никотинамид вносили в среду инкубации за 3 ч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.