ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 5, с. 565-575
УДК 547.915:577.150.8
АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И СТРАТЕГИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ У ГРИБОВ (ОБЗОР)
© 2007 г. Т. А. Белозерская, Н. Н. Гесслер
Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва, 119071 e-mail: tab@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 15.11.2006 г.
Уровень активных форм кислорода (АФК) в клетке регулирует процессы роста и дифференциров-ки грибного организма. В обзоре рассмотрены пути возникновения и способы защиты грибов и дрожжей от первично образующихся АФК, а также участие тиоловых соединений в антиоксидант-ной защите грибной клетки. Показано, что процесс адаптации грибов к окислительному стрессу тесно связан с редокс-зависимым изменением активности компонентов антиоксидантной защиты.
Гипотеза о присутствии активных форм кислорода (АФК) в живых клетках возникла задолго до их обнаружения. В середине 19 века швейцарский химик Х.Ф. Шенбайн выдвинул представление об активировании молекулы кислорода (02) как необходимом условии осуществления процессов биологического окисления [1]. А.Н. Бах отмечал, что: "потребовалось более полустолетия на более или менее методическую разработку того поля, на котором Шенбайн расставил столько вех" [2]. Исторически первой экспериментально обнаруженной АФК является наиболее устойчивая из них - перекись водорода (Н202). А.Н. Баху удалось показать присутствие Н202 в водных вытяжках из листьев некоторых растений - герани, хризантемы, лавровишни, крапивы и других [2].
Позднее положение об образовании органических перекисей и Н202 в биологических процессах легло в основу перекисной теории А.Н. Баха, исторически первой биохимической концепции окислительных процессов в живых системах.
Как показали А.Н. Бах и Р. Шода [2], некоторые организмы, включая грибы, могут нормально развиваться в присутствии Н202 в концентрации до 1%. Это свойство грибных организмов позволяет им осваивать всевозможные экологические ниши. В связи с этим встает вопрос, какие же системы в грибной клетке обеспечивают устойчивость к действию различных неблагоприятных факторов.
Грибы применяются для получения широкого круга соединений. Эффективность биотехнологических процессов непосредственно связана с метаболической активностью продуцентов [3], поэтому изучение антиоксидантной защиты (АЗ) и путей ее регуляции в клетках грибов является актуальным направлением исследований. В данном обзоре основное внимание уделяется путям возникновения и способам защиты клеток грибов от первично образующихся АФК, а также широ-
ко развивающемуся в последние годы направлению - исследованию участия тиоловых соединений в АЗ.
ОБРАЗОВАНИЕ АФК В КЛЕТКЕ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РАЗВИТИЕ ГРИБОВ
Молекула 02 стабильна и реагирует с большинством органических молекул очень медленно. 06-разование в клетке Н202 и других АФК - супероксидного анион-радикала (О-), пероксидного радикала (Н О-), пероксидного иона (Н О2), кислорода в его возбужденном синглетном состоянии (Ю2), гидроксильного радикала (0И') - неразрывно связано с вовлечением 02 в окислительно-восстановительные метаболические реакции - окисление органических субстратов в процессе дыхания, обеспечение иммунных и защитных реакций, а также с активацией 02 под действием внешних факторов [4]. В процессе дыхания часть используемого митохондриями кислорода (2-5%) восстанавливается не полностью, образуя при этом
супероксидный анион-радикал О-.
Сверхчувствительный метод определения О-в интактной клетке, основанный на количественном флуорометрическом анализе образующегося дигид-
роэтидина, оценивает скорость образования О2 у Saccharomyces cerevisiae на уровне 6-7 нмоль/мин, а при внесении редокс-медиатора менадиона она возрастает на порядок [5]. Как промежуточный
продукт О- помимо дыхательной цепи возникает в реакциях с участием ксантиноксидазы, микро-сомальных монооксигеназ, липоксигеназы, а также в результате самоокисления тиолов, флави-
нов, хинонов, катехоламинов, восстановительного цикла ксенобиотиков [4].
У Aspergillus nidulans супероксидный стресс приводит к изменению экспрессии генов [6] и запускает дифференцировку клейстотециев (органов полового воспроизведения) [7]. Слияние миксамеб и последующая дифференцировка у миксомицетов Dictyostellium discoideum сопровождается увеличением внеклеточного и внутриклеточного 02. [8]. У аскомицетов Podospora anserina и Neurospo-
ra crassa при недостатке внутриклеточного 02 нарушается половой процесс и прорастание аско-спор [9, 10].
При трансформации 02^, протекающей как спонтанно, так и с участием супероксиддисмутаз (СОД), возникает Н202. Исследование образования H202 у гриба Sclerotium rolfsii перед началом дифференцировки (начало образования склероциев) позволило количественно оценить скорость ее образования в мицелии в пределах 4 ± 0.5 нмоль/мин/г сухой биомассы и ее увеличение в 2.5 раза при освещении или добавлении ионов железа [11].
У грибов H202 в качестве сигнальной молекулы принимает участие в таких процессах, как изменение скорости роста, дифференцировка и пролиферация [12-16]. Показано, что Н202 влияет на активность генов у A. nidulans, включая гены A3 [6], вызывает дифференцировку склероциев у S. rolfsii [11] и переход к филаментному росту и проявлению патогенности у Ustilago maydis [17], а также активирует каротиногенез у N. crassa [18].
H202 способна реагировать с металлами переменной валентности, например с Fe2+ и Cu+ (реакция Фентон) или с 02^ (реакция Хабер-Вайс) с образованием крайне активного радикала 0 H . Время жизни 0H' мало (менее 1 нс), при этом скорость его действия очень велика (константа скорости 109-1010 л моль-1 с-1). 0H' способен реагировать практически со всеми биомолекулами, вызывая окисление ДНК, белков и липидов [4].
Действие света видимой области спектра способствует внутриклеточному образованию х02 [19]. х02 реагирует с биомолекулами, например, с жирными кислотами и основаниями ДНК, образуя Н202 и гидропероксиды [4]. х02 стимулирует прорастание спор у N. crassa, процесс образования конидий, синтез каротиноидов [10, 20, 21]. Ионизирующее излучение (a-, ß-, у-, рентгеновские лучи), ультрафиолетовое излучение (дальний 200-290 нм, средний 290-320 нм и ближний 320-420 нм) способствуют образованию АФК в клетках и оказывают существенное влияние на физиологическую активность микроскопических грибов [22, 23].
Кроме того, необходимо упомянуть, что изменение рН среды, температуры, осмотичности, парциального давления кислорода, а также концентрации субстратов, высушивание, механические повреждения и другие факторы внешней среды, влияющие на рост и развитие микроорганизмов, вызывают формирование кислородных радикалов внутри грибной клетки [10, 12, 16, 22, 23].
Наряду с приведенными выше источниками АФК следует упомянуть еще три фермента в клетках грибов, продуцирующих АФК и участвующих в регуляции развития эукариот: НАДФН-оксидаза (КОХ) [10], глиоксальоксидаза [17], N0-синтаза [24, 25].
Превышение генерации АФК над способностью клетки к их нейтрализации может вызывать состояние гиперокисления - окислительный стресс. В отличие от процесса роста и дифференцированного состояния, нестабильное состояние, возникающее в результате окислительного стресса, может привести к развитию патологических процессов и, в конце концов, к клеточной гибели. Признаки апоптоза выявлены у дрожжей и грибов [26, 27].
Состояние окислительного стресса у грибов характеризуется массовым окислением белков и их последующей деградацией, гликозилированием и карбонилированием белков, высвобождением свободных ионов железа при окислении [4Бе-48] кластеров дегидрогеназ, окислением глутатиона и экскрецией его дисульфида во внеклеточную среду, изменением уровня восстановленности пиридиновых нуклеотидов и изменением активности системы АЗ [10, 12, 28-30]. Перестройка метаболизма ведет к прекращению роста и синтезу вторичных метаболитов в грибных клетках, многие из которых являются антиоксидантами [3, 23, 31]. В период, предшествующий основным этапам дифференцировки в процессе онтогенеза N. crassa - агрегации гиф, формированию воздушных гиф, образованию конидий - регистрируется хемилюминесценция низкого уровня, стимулируемая люцигенином и люминолом. Антиоксиданты снимают хемилюминесценцию и прекращают дифференцировку, что подтверждает формирование АФК перед каждой стадией в ходе развития N. crassa [10]. У S. т^п наблюдается прекращение дифференцировки склероциев под действием антиоксидантов [16].
Одним из ответов грибов на действие стрес-сорных факторов является возрастание доли циа-нидрезистентного дыхания, связанного с переносом электронов от убихинона дыхательной цепи непосредственно на О2 с образованием Н20 под действием альтернативной оксидазы. Предполагается, что достигаемое при этом окисление убихинона снижает образование АФК в дыхательной цепи [3]. Альтернативная оксидаза активизирует-
ся в клетках грибов при переходе к стационарной фазе роста и в стрессовых условиях [3, 32, 33].
Различные АФК вызывают экспрессию определенных генов, отвечающих за специфичность физиологических ответов грибов. У А. тёы1ат
при действии одного из факторов (Н202, О^Т или диамида, вызывающего снижение окислительно-восстановительного потенциала клетки) из 3533 генов изменение экспрессии наблюдались у 2499 генов [6]. Количество генов, избирательно отвечавших на
воздействие одного фактора, составляло для О-7.7%, для Н202 - 32.6%, а для диамида - 13% [6].
АФК (О2, Н202) у А. тёы1ат изменяли профиль экспрессии генов, которые кодируют белки, связанные с транспортными процессами и синтезом аминокислот, а также принимающие участие в половым воспроизведении и споруляции. Специфичность генетических ответов грибов снижается при действии доз АФК, близких к летальным [6].
Таким образом, АФК в грибной клетке возникают при вовлечении 02 в метаболические процессы, при действии внешних факторов, а также в результате функционирования специфических ферментных систем. АФК с одной стороны оказывают повреждающее действие на клетки, а с другой - вызывают дифференцировку у грибов. Смена фаз развития происходит через неус
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.