ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 463, № 2, с. 230-233
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 616-006.66:577.17.05
АЛЬФА-КОНОТОКСИНЫ ВЫЯВИЛИ РАЗНУЮ РОЛЬ ПОДТИПОВ НИКОТИНОВЫХ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ В ОНКОГЕНЕЗЕ ОПУХОЛИ ЭРЛИХА И СОПРОВОЖДАЮЩЕМ ЕГО ВОСПАЛЕНИИ
© 2015 г. Т. И. Терпинская, А. В. Осипов, Т. Е. Кузнецова, Е. Л. Рыжковская, В. С. Улащик, И. А. Иванов, член-корреспондент РАН В. И. Цетлин, Ю. Н. Уткин
Поступило 19.01.2015 г.
Многократное введение в дозе 1 нмоль/кг мышам-носителям карциномы Эрлиха конотоксинов М11, блокирующего альфа3бета2- и альфаб-содержащие рецепторы, или АгГБИЫбО, ингибирующе-го с высокой эффективностью альфа7-подтип н-АХР, сопровождается снижением активности лактат-дегидрогеназы в опухолевых клетках и уменьшением лейкоцитарного воспалительного инфильтрата в опухолевой ткани. При воздействии конотоксином Аг1Б11Ь1бВ отмечался патоморфоз в опухолевой ткани первой степени, а конотоксинами и М11 — второй степени. Только введение коноток-сина М11 достоверно привело к торможению роста опухоли. Результаты свидетельствуют об участии никотиновых ацетилхолиновых рецепторов в регуляции метаболических процессов и межклеточных взаимодействий, связанных с онкогенезом и опухольассоциированным воспалением.
DOI: 10.7868/S0869565215200256
Развитие опухоли in vivo ассоциировано с процессом воспаления. Известно, что никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (н-АХР) участвуют в процессах онкогенеза [1] и воспаления [2]. Одним из широко используемых инструментов исследования н-АХР являются альфа-конотоксины яда морских улиток рода Conus, избирательно и с высокой эффективностью блокирующие различные подтипы н-АХР [3]. Однако в литературе отсутствуют сведения о воздействии альфа-коно-токсинов на процесс онкогенеза in vivo и сопровождающее его воспаление. В настоящей работе впервые описывается влияние внутрибрюшинно-го введения альфа-конотоксинов животным с карциномой Эрлиха на морфофункциональные характеристики опухолевых клеток и лейкоцитарного инфильтрата в зоне опухоли.
Опыты проводили на мышах линии A//WySn-Mv, поддерживаемой в виварии Института физиологии НАН Беларуси. В работе использовали альфа-конотоксины: MII — селективный блока-тор подтипа н-АХР альфа3бета2- и альфаб-содер-жащих подтипов рецептора, ArIB11L16D — с высоким сродством ингибирующий н-АХР подтипа альфа 7, и RgIA — блокатор подтипа альфа 9-аль-
Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси, Минск
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Москва E-mail: osipov@mx.ibch.ru; osipov-av@ya.ru
фа 10 [3]. Все конотоксины получены путём пептидного синтеза [4]. Клеточную линию перевиваемой карциномы Эрлиха (КЭ) вводили мышам подкожно в дозе б млн клеток на мышь, опухолевые клетки получали из поддерживаемой путем внутрибрю-шинных перевивок асцитной формы КЭ. Начиная со дня инокуляции опухоли животным 1 раз в сут вводили внутрибрюшинно препараты конотокси-нов в следующих дозах: — 0.1 нмоль/кг, М11 и Аг1Б11Ь1бВ — 1 нмоль/кг. Курс составил 12— 13 инъекций в течение 1б—17 дней с двумя 2-дневными перерывами. Объем опухоли определяли согласно [5]. На 16-17-е сут роста опухоли, через 40 мин после последней инъекции препаратов, у животных выделяли опухолевую ткань и готовили препараты для флуоресцентно-микроскопического и гистохимического исследования (по 5 образцов для каждой серии). Криостатные срезы для обзорной характеристики структуры опухоли окрашивали по общепринятой методике гематоксилин-эозином. Патоморфоз опухолевой ткани определяли по методике Лавниковой [б]. Выраженность воспалительной реакции оценивали с помощью люминесцентного метода с применением флюорохрома — акридинового оранжевого [7]. Характер флуоресценции различных клеточных структур после окраски акридиновым оранжевым отражает цитохимические процессы, которые, в свою очередь, связаны с функциональным состоянием клеточных элементов [8]. Акридиновый оранжевый адсорбируется нуклеиновыми кисло-
АЛЬФА-КОНОТОКСИНЫ ВЫЯВИЛИ РАЗНУЮ РОЛЬ
231
Рис. 1. Ткань карциномы Эрлиха без инъекции мышам конотоксина (контроль). Представлен участок ткани с обильной инфильтрацией лимфоцитами. Стрелками показаны несколько ярко светящихся ядер лимфоцитов, покрывающих все поле зрения. Линией обведены зоны со слабой лимфоцитарной инфильтрацией, представленные в основном клетками опухоли (здесь и далее КО). Темные пятна — очаги некроза. Здесь и на рис. 2—4 флюорохром — акридиновый оранжевый, увеличение в 16 раз.
тами и нуклеопротеидами, придавая им соответствующее свечение. Ядерная ДНК дает при этом ярко-зеленое свечение, а протоплазматическая РНК светится красным светом, что позволяет в известной мере идентифицировать нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды дезоксирибозного и рибозного типов в клеточных элементах. При деполимеризации ядерных нуклеиновых кислот, понижении жизнеспособности клеток (паранекроз) и некрозе цвет свечения изменяется от зеленого к красному. Активность ферментов углеводно-энергетического обмена — сукцинатдегидро-геназы (СДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) — определяли тетразолиевым методом [9]. Об активности окислительно-восстановительных ферментов (СДГ и ЛДГ) в опухолевых клетках судили по плотности конечного продукта реакции — ди-формазана — в цитоплазме клеток с помощью компьютерной программы обработки данных Image J (National Institutes of Health, США), выражая результаты в условных единицах оптической плотности (у. е.). В каждом из пяти срезов измерения выполняли на 100 клетках. Полученные данные обработаны методами стандартной статистики и представлены в виде средней арифметической величины и её стандартной ошибки (M ± m).
В результате работы установлено, что инъекция животным с привитой КЭ конотоксинов MII, RgIA и ArIB11L16D приводила к торможению роста опухолей на 70 (p < 0.05), 43 (p > 0.05) и 35% (p > 0.05) соответственно.
Рис. 2. Ткань карциномы Эрлиха после воздействия конотоксина Кя1А. Наблюдается скопление лейкоцитов вблизи зон некроза. Стрелками обозначены некоторые из множества ярко флуоресцирующих ядер клеток лейкоцитарного ряда, линией обведены зоны, представленные в основном КО. Тёмные пятна — зоны выраженного некроза (участки соединительной ткани, состоящие в основном из коллагена, с разрушенными и утратившими нуклеопротеиды клеточными структурами, с которыми акридиновый оранжевый не связывается, поэтому флуоресценция отсутствует). Светящийся агломерат — скопление лейкоцитов вблизи зон некроза.
При введении конотоксинов Я§1А и М11 в опухолевой ткани наблюдали вторую степень пато-морфоза, характеризующуюся очаговым исчезновением паренхимы и увеличением зон некроза. При воздействии конотоксином Аг1Б11Ь16В отмечался патоморфоз первой степени, при этом структура опухоли оставалась практически такой же, как у опухоли, не подвергавшейся действию токсина.
При микроскопическом исследовании в препаратах КЭ обнаружили выраженную воспалительную инфильтрацию, представленную клетками лейкоцитарного ряда (рис. 1). Ядра многочисленных лейкоцитов, окрашенные акридиновым оранжевым, имели ярко-зеленую окраску, цитоплазма — тускло-зеленую. Все ярко светящиеся точки на рис. 1 — ядра лейкоцитов, на их фоне опухолевые клетки практически не видны. Для клеточных элементов типа макрофагов характерной особенностью являлось ярко-желтое или оранжевое свечение ядер. На отдельных участках клетки образовывали огромные конгломераты. При большем увеличении (данные не представлены) в клетках опухоли видны светящиеся нити ДНК (светятся слабее, чем ядра лимфоцитов), цитоплазма более темная и часто с красноватым оттенком. При паранекрозе изменяется ядерное свечение — до желтого или даже до красного. Ядра лимфоцитов и макрофагов светятся гораздо ярче, при этом лимфоциты намного меньше по размерам опухолевых клеток. Макрофаги идентифици-
232
ТЕРПИНСКАЯ и др.
КО
КО КО КО
V / КО
Рис. 3. Ткань карциномы Эрлиха после воздействия конотоксина МП. Ткань представлена в основном слабо светящимися КО с немногочисленными лейкоцитами. Некоторые из ярко светящихся ядер клеток лейкоцитарного ряда обозначены стрелками. Основная масса клеток в поле зрения — КО. Темные пятна — очаги некроза.
руются по яркому свечению ядра и по включениям в цитоплазме.
После инъекций конотоксина Я§1А в срезах КЭ (рис. 2) в полиморфно-ядерных лейкоцитах, покрывающих все поле зрения и образующих ярко флуоресцирующие конгломераты, мы обнаружили ряд структурных изменений дегенеративного характера, что выражалось в переходе их свечения от ярко-зеленого к желтому и оранжевому. При большем увеличении в теле макрофагов наблюдали фагоцитированные фрагменты лейкоцитов с ярко-желтым или оранжевым свечением. Эти фрагменты, вероятно, большей частью представляют собой остатки нейтрофилов, коротко-живущих клеток, первыми мигрирующих в очаг воспаления и погибающих в течение часов или суток. Погибшие нейтрофилы (как и другие погибшие и разрушенные клетки) фагоцитируются макрофагами, дифференцировавшимися из мигрировавших в зону воспаления моноцитов. При ассоциированном с развитием опухоли хроническом воспалении в опухолевой ткани присутствуют и нейтрофилы, и макрофаги, и лимфоциты. Помимо своих функций, они отличаются морфологически — формой ядра и цитоплазматически-ми гранулами, но когда клетка разрушена, ее точно идентифицировать трудно, поэтому в нашем случае мы говорим о фагоцитированных лейкоцитах.
После инъекций конотоксинов М11 (рис. 3) и Аг1Б11Ы6Э (рис. 4) на срезах КЭ выявлялись немногочисленные лейкоциты с неровными краями, утратившие нормальную круглую форму. На рис. 4 преобладают опухолевые клетки с единич-
Рис. 4. Ткань карциномы Эрлиха после воздействия конотоксина Аг1Б11Ь16В. Ткань представлена в основном слабо флуоресцирующими КО с единичными лейкоцитами (обозначены стрелками). Темные пятна — очаги некроза.
ными вкраплениями лейкоцитов. На отдельных участках флуоресценцию не наблюдали, определялись лишь клетки без видимой структуры ядра с явлениями вакуолизации.
Как отмечалось ранее [8], характер флуоресценции различных клеточных структур, окрашенных акриди
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.