МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 78, № 4, с. 496-505
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.841.5.(6-285.2)
ALKALIPHILUS PEPTIDOFERMENTANS SP. NOV., НОВАЯ АЛКАЛОФИЛЬНАЯ БАКТЕРИЯ ИЗ СОДОВОГО ОЗЕРА, СБРАЖИВАЮЩАЯ ПЕПТИДЫ И ВОССТАНАВЛИВАЮЩАЯ Fe(III)
© 2009 г. Т. Н. Жилина*1, Д. Г. Заварзина*, Т. В. Колганова**, А. М. Лысенко*, Т. П. Турова*
*Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва
**Центр "Биоинженерия" РАН, Москва Поступила в редакцию 01.07.2008 г.
Из целлюлозоразлагающего консорциума, полученного из пробы донных отложений низкоминерализованного содового озера Верхнее Белое (Бурятия), выделена новая анаэробная спорообразующая бактерия штамм Z-7036. Клетки в виде подвижных коротких грамположигельных палочек размером 1.1-3.0 х 0.25-0.4 мкм. Окситолерантный анаэроб. Облигатный алкалофил, развивающийся в области рН 7.5-9.7 с оптимумом рН 9.1. Мезофил. Галотолерант, способный развиваться при концентрациях NaCl от 0 до 50 г/л с оптимумом 20 г/л. Нуждается в карбонатах. Сбраживает пептон, дрожжевой экстракт, триптиказу, триптон, сойтон "Bacto", мясной экстракт, казаминовые кислоты, орнитин, аргинин, треонин, триптофан. Гидролизует клетки бакпрепаратов "гаприн" и "Spirulina". Основные продукты брожения - ацетат и формиат. Способен к восстановлению аморфной гидроокиси окисного железа
2_
(АГОЖ), ЭДТА-Ре(Ш), антрахинон-2,6-дисульфоната (хинона), S2O3 , фумарата, кротоната. Основные жирные кислоты - C16 : 0, C16 : 1щ7с, iso-C17, iso-C15 и iso-C17 : 1. Содержание Г + Ц в ДНК 33.8 ± 0.5 мол%. По данным анализа 16S рРНК является членом рода Alkaliphilus кластера XI грамположигельных бактерий с низким Г + Ц семейства Clostridiaceae. Ближайшим родственником выделенного штамма являются A. transvaalensis SAGM1T и A. crotonatoxidans B11-2T (93.3 и 93.9% сиквинс подобия). На основании фе-нотипических и филогенетических отличий предлагается отнести выделенный штамм к новому виду Alkaliphilus peptidofermentans sp. nov.
Ключевые слова: брожение пептидов, содовые озера, алкалофилы, анаэробы, железоредукция, Alka-liphilus.
Вероятным компонентом микробного сообщества содовых озер должны быть анаэробные организмы, разлагающие мортмассу первичных и/или вторичных продуцентов. Они должны располагаться в начале пептолитического пути и быть способны к сбраживанию азотсодержащих компонентов мортмассы.
В целлюлозоразлагающем сообществе низкоминерализованного содового озера Верхнее Белое (Бурятия), где доминирующим является сахаролити-ческий путь [1], нами был обнаружен микроорганизм, не использующий ни углеводы, ни продукты их сбраживания, но способный расти как на растворимых белковых экстрактах, так и на отдельных аминокислотах, но, главное, использующий мортмассу бакпрепаратов как первичных "Spirulina", так и вторичных - высушенную биомассу Methylococcus ("гаприн") - продуцентов.
Кроме того, выделенная бактерия оказалась способна к железоредукции с использованием окисного железа в комплексе с ЭДТА, но также в виде аморф-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: zhilinat@mail.ru).
ной гидроокиси оксидного железа (АГОЖ). До настоящего времени был известен лишь один алкало-фильный организм Geoalkalibacter ferrihydriticus, способный восстанавливать АГОЖ с образованием магнетита или сидерита [2]. Одновременно с микроорганизмом, таксономическое описание которого предлагается в этой статье, нами выделены еще два новых представителя рода Natronincola, также обладающих способностью восстанавливать железо в нерастворимой форме [4]. Таким образом, эта функция алкалофильных анаэробов, недавно ставившаяся под сомнение из-за низкой подвижности железа в щелочных условиях [3], находит все большее фактическое подтверждение.
В этой статье мы описываем нового представителя рода Alkaliphilus, изолированного из содового озера и способного к восстановлению железа в нерастворимой форме при сбраживании пептидов.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Источник выделения. Штамм 7-7036 являлся компонентом микробного анаэробного сообщества,
ALKALIPHILUS PEPTIDOFERMENTANS SP. NOV., НОВАЯ АЛКАЛОФИЛЬНАЯ
497
разлагающего целлюлозу, где целлюлозоразлагаю-щим организмом был Clostridium alkalicellulosi [1], а использующим углеводы при гидролизе целлюлозы - Alkaliflexus imshenetskii [5]. Исходным материалом для развития сообщества служила проба из донного осадка прибрежной лагуны оз. Верхнее Белое (Бурятия) с рН 10 и минерализацией 7.5 г/л.
Условия культивирования. Минеральная среда для избирательного накопления и выделения нового изолята содержала (г/л): KH2PO4 - 0.2; MgCl2 ■
■ 6Н20 - 0.1; NH4Cl - 0.5; KCl - 0.2; NaCl - 1; Na2SO4 - 3; Na2CO3 - 3; NaHCO3 - 10; дрожжевой экстракт "Difco" - 0.2; пептон "Difco" - 2; Na2S ■
■ 9H2O - 0.5; раствор микроэлементов - 1 мл/л [6]. В оптимизированной среде содержание натриевых солей составило (г/л): Na2CO3 - 3.0; NaHCO3 - 12.0; NaCl - 5.0 (0.28 М Na+); дрожжевого экстракта - 3. Остальные компоненты оставлены без изменений. pH среды 9.5. Инкубацию проводили в темноте при 37°С в течение недели.
Для выявления используемых для катаболизма субстратов их вносили в концентрации 3 г/л. Углеводы вносили в щелочную среду из концентрированных стерильных водных растворов непосредственно перед посевом. Приготовление среды и культивирование проводили в строго анаэробных условиях в атмосфере азота. Используемые в качестве акцепторов электронов АГОЖ и ЭДТА-Ре(Ш) готовили как ранее [2].
Физиологические характеристики. Акцепторы электронов добавляли из концентрированных растворов в стерильную среду без NH4Cl в концентрациях (мМ): Na2S2O4 - 1; Na2SO3 - 2 и 20; Na2S2O3 ■
■ 5H2O - 10; Na2SO4 - 20; NaNO2 - 2 и 10; NaNO3 - 10; антрахинон-2,6-дисульфонат - 20; Mn(IV) - 25 в виде искусственно синтезированного MnO2; ЭДТА-Fe(III) - 20 + цистеин (0.3 г/л); АГОЖ - 90 по Fe(III) + + цистеин (0.3 г/л); цитрат Fe(III) - 5; S° - 2% (вес/объем); кротонат - 10; фумарат - 5.
Для получения рН-зависимости нужные значения рН устанавливали подтитровкой среды 10% HCl или 10% NaOH, при этом карбонат натрия в среде заменяли бикарбонатом натрия и уменьшали его концентрацию в 10 раз, выравнивая молярность по натрию хлоридом натрия. pH контролировали до и после эксперимента. Значения рН в конце эксперимента смещались незначительно, не более 0.2 единиц в область низких значений рН. Потребность в NaCl, зависимость от карбонатов и их оптимальную концентрацию и пределы для роста исследовали как описано [4]. Температурную зависимость исследовали в области от 18 до 60°С при оптимальных значениях рН и концентрации хлорида натрия.
Способность к микроаэрофильному росту и возможности потребления 02 проверяли добавлением 02% (0.2; 0.4; 1.4; 2.3; 4.2; 7; 9.3) к анаэробно приготовленной под N2 среде без восстановителя с последующим измерением роста по 0П600 и концентра-
ции 02 на газовом хроматографе в начале и конце роста.
Тест на каталазу проводили действием 3%-ного раствора перекиси водорода на клетки бактерий.
Определение чувствительности штамма к антибиотикам проводили добавлением их стерильных концентрированных растворов в среду с конечной концентрацией 100 мг/л.
Аналитические методы. Рост оценивали измерением оптической плотности культур в пробирках Хангейта при 600 нм в спектрофотометре Specol-10 (Jena) или UNIC0-2100. Водород, кислород и азот измеряли на газовом хроматографе ЛХМ-80 с ката-рометром. Жирные кислоты и спирты измеряли методом ВЭЖХ на хроматографе Стайер (Россия) с рефрактометрическим детектором. Разделение проводили на колонке Aminex HPX-87H ("Bio-Rad", США) с элюентом 5 мМ H2S04. Растворенный сероводород определяли колориметрически методом Пахмайра с ^^диметил-р-фенилендиамином по образованию метиленовой сини в модификации [7]. Восстановление азотистых соединений определяли по способности к образованию N2 в среде с аргоном
как газовой фазой; образование NH+ из NO^- или
N03 - в реакции с реактивом Несслера. Восстановление Fe(III) - колориметрическим методом в реакции с феррозином, предварительно растворив осадок в 0.6 н HCl [8]. Восстановленные железосодержащие минералы, образующиеся в процессе роста микроорганизма, определяли методом мессбау-эровской спектроскопии [9]. Состав жирных кислот (Жк) в липидах микроорганизмов определяли на хроматографе Microbial Identification System (Sherlock), фирмы "MIDI Inc." (Newark, США) по методике [10]. Идентификацию разделенных ЖК проводили на масс-спектрометре Agilent Technologies AT-5971 SMART.
Морфология. Живые клетки исследовали в фа-зово-контрастном микроскопе ZETOPAN (Австрия). Срезы и клетки, окрашенные 1% ФВК для выявления жгутиков, просматривали в электронном микроскопе JEM-100C (Япония).
Анализ ДНК. Содержание Г + Ц пар в составе ДНК определяли по кривым термической денатурации согласно методикам, как ранее [11].
Выделение ДНК, амплификация и секвениро-вание генов 16S рРНК. Выделение и очистку препаратов ДНК проводили согласно методике, описанной ранее [12].
Для проведения амплификации и секвенирова-ния генов 16S рРНК использовали универсальные для бактерий праймеры [13].
Секвенирование продуктов амплификации проводили по Сэнгеру с помощью набора Big Dye Terminator v.3.1 на автоматическом секвенаторе ABI
3730 ("Applied Biosystems, Inc.", США) согласно инструкциям производителя.
Филогенетический анализ последовательностей гена 16S рРНК. Редактирование последовательностей проводили с помошью редактора BioEdit [http:// jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html]. Первичный сравнительный анализ полученных de novo последовательностей с последовательностями из базы данных GenBank проводили с помошью программы NCBI BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast]. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК штаммов были выровнены с соответствуюшими последовательностями ближайших видов бактерий с помошью программы CLUSTALW v 1.75. Построение филогенетического дерева исследуемых штаммов производили с помошью методов, реализованных в пакете программ TREECONW [http://biocwww.uia.ac.be/u/yvdp/treeconw.html] и PHYLIP [http://evolution.genetics.washington. edu/phylip. htm
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.