МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 491-497
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК582.282.123.2.017.73
АЛКАЛОИДЫ ГРИБА PENICILLIUM AURANTIOGRISEUM DIERCKX (1901) VAR. AURANTIOGRISEUM BKM F-1298
© 2004 г. H. Г. Винокурова, Б. П. Баскунов, Н. Ф. Зеленкова, М. У. Аринбасаров1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 27.10.03 г.
Показано, что штамм Pénicillium aurantiogriseum var. aurantiogriseum BKM F-1298 является продуцентом двух бензодиазепиновых алкалоидов - анацина и аурантина, а также дикетопиперазинового алкалоида аурантиамина. При синтезе алкалоидов глубинным способом на среде Абе большая часть алкалоидов экскретируется в среду. Накопление аурантина и аурантиамина в культуральной жидкости имеет четко выраженный максимум, а содержание анацина остается постоянным длительное время. Максимальное накопление аурантина и аурантиамина наблюдается в идиофазе, а синтез анацина протекает параллельно росту культуры.
Ключевые слова: Pénicillium aurantiogriseum, алкалоиды, анацин, аурантин, аурантиамин.
Грибы Pénicillium aurantiogriseum известны как наиболее распространенный в мире вид пеницил-лов, поражающих хлебные злаки [1]. Изучение микрофлоры продовольствия в областях с широким распространением Балканской эндемичной нефропатии позволило выделить изоляты Penicillium aurantiogriseum, продуцирующие водорастворимый нефротоксин [2, 3]. Показана прямая зависимость нефротоксического эффекта мицелия изолятов Penicillium aurantiogriseum и P. commune, выделенных из собранной в Югославии плесневелой кукурузы, и продукции аурантина и других бензодиазепиновых алкалоидов данными культурами [4]. Один из изолятов Penicillium aurantiogriseum был описан как продуцент нового бензодиа-зепинового алкалоида анацина [5].
Целью данной работы явилось изучение спектра вторичных метаболитов алкалоидной природы и особенностей их биосинтеза у гриба Penicillium aurantiogriseum var. aurantiogriseum BKM F-1298, выделенного с корней кукурузы (Украина, Хмельницкая область).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали штамм Penicillium aurantiogriseum Dierckx (1901) var. aurantiogriseum BKM F-1298, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ). Культуры выращивали при 24 ± 1°C в колбах Эрлейнмейера на 750 мл со 100 мл среды Абе (г/л H2O): маннит -50.0, янтарная кислота - 5.4, MgSO4 ■ 7H2O - 0.3, KH2PO4 - 1.0, pH среды доводили 25%-ным водным раствором NH4OH до 5.2, приготовленной на
1 Автор для корреспонденции (e-mail: arin@ibpm.pushchino.ru).
водопроводной, дистиллированной воде и дистиллированной воде с добавлением микроэлементов [6]. Микроэлементы вносили перед засевом в виде стерильных растворов солей до концентрации (мг/л среды): FeSO4 ■ 7H2O - 5.0, ZnSO4 ■ 7H2O - 4.4, MnSO4 ■ 5H2O - 1.7, CuSO4 ■ 5H2O - 3.3, Na2MoO4 -2.4. Также использовали среду Чапека-Докса с 0.5% дрожжевого экстракта [5]. Штамм поддерживали на скошенном сусле-агаре. Посев проводили спорами. Культивирование осуществляли как в условиях принудительной аэрации (на качалке, 220 об/мин), так и в стационарных условиях.
Метаболиты выделяли из фильтрата культуральной жидкости и из мицелия. Фильтрат подщелачивали аммиаком до pH 7-8 и дважды экстрагировали этилацетатом. Объединенные вытяжки сушили безводным Na2SO4, фильтровали и упаривали на роторном испарителе досуха. Из мицелия метаболиты выделяли тремя способами: двукратной экстракцией смесью хлорофом-метанол (2 : 1, об/об) из сырого мицелия [7], экстракцией ацетоном из биомассы, высушенной лиофильным способом [5], и экстракцией этилацетатом из разрушенного на гомогенизаторе MPW-302 (Польша) мицелия.
Качественный анализ полученных экстрактов осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах силуфола УФ-254 фирмы "Kavalier" (Чехия) в системах: хлоро-форм-метанол-25%-ный NH4OH (90 : 10 : 1) (I), (90 : 10 : 0.1) (II), (80 : 20 : 0.2) (III).
При изучении динамики накопления метаболитов опыты проводили в трех повторностях. Количественный анализ полученных экстрактов осуществляли высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Работу выполняли на жидкостном хроматографе, оборудованном УФ-детектором с
переменной длиной волны и интегратором "LKB-Pribori AB" (Швеция). В работе использована колонка Nova-Pak C18, 150 см х 4.6 мм ("Waters", США). Рабочая длина волны - 230 нм, температура анализа - 25°C, расход элюента - 0.9 мл/мин. Элюирование проводили системой: метанол-во-да-25%-ный аммиак (40 : 60 : 0.036% об). В зависимости от природы определяемого вещества величина относительного стандартного отклонения (n = 3, P = 0.95) составляла 0.24-0.85.
Для наработки метаболитов использовали среду Абе, приготовленную на дистиллированной воде с микроэлементами. Предварительное деление смеси метаболитов на отдельные компоненты осуществляли методом колоночной хроматографии на сили-кагеле L40/100 мкм фирмы "Chemapol" (Чехия) в градиентной системе хлороформ-метанол, содержащий 1% концентрированного водного аммиака. Соотношение компонентов менялось от 100 : 0 до 80 : 20. Контроль за разделением метаболитов осуществляли методом ТСХ. Фракции, содержащие алкалоиды, объединяли, упаривали и очищали: ау-рантиамин перекристализовывали из этилацетата; аурантин очищали на стеклянной пластинке с сили-кагелем LSL ("Chemapol", Чехия) в системе хлороформ-ацетон (4 : 1); анацин и его изомер разделяли на пластинах силикагель 60/кизельгур F254 ("Merck", ФРГ) в системе I.
Электронные спектры поглощения метаболитов получали в метаноле с использованием спектрофотометра UV-160A фирмы "Shimadzu" (Япония).
Элементный состав полученных соединений, а также основных фрагментов спектра определяли из масс-спектров высокого разрешения, записанных на приборе Finnigan MAT модель 8430 (Германия) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Грибы вида Penicillium aurantiogriseum относятся к сложной систематической группе грибов рода Penicillium, имеющих сходные морфологические и физиологические признаки и отличающихся набором продуцируемых вторичных метаболитов [1, 8]. По Питту синонимами P. aurantiogriseum Dierckx (1901) являются P. puberulum Bainier (1907), P. cyclo-pium Westling (1911), P. aurantiovirans Biourge (1923), P. lonoso-coeruleum Thom (1930) и P. verrucosum var. cyclopium (Westling) Samson (1976) [3]. Лунг и Фрис-вад, исследовав 519 изолятов коллекции NRRL, объединенных в состоящую из P. cyclopium, P. virid-icatum и P. ochraceum серию, обнаружили абсолютное сходство микроморфологических признаков этих грибов. Причем на основе биосинтетических семейств вторичных метаболитов с учетом нескольких менее заметных морфологических и физиологических различий изоляты, ранее отнесенные к видам P. cyclopium, P. viridicatum были выде-
лены в 9 видов: P. aurantiogriseum, P. aurantiovirans, P. cyclopium, P. viridicatum, P. freii, P. melanoconidium, P. neoechinulatum, P. polonicum и P. tricolor [1].
При тщательном исследовании морфологических и хемотаксономических признаков Фрисвад разбил вид P. aurantiogriseum на несколько хемо-типов: собственно P. aurantiogriseum Dierckx (1901) var. aurantiogriseum, P. aurantiogriseum var. melanoconidium Frisvad, var. nov., P. aurantiogriseum var. neoechinulatum Frisvad (1987), P. aurantiogriseum var. polonicum (Zaleski) Frisvad, comb. nov. и P. aurantiogriseum var. viridicatum (Westling) Frisvad and Filenborg, comb. nov. [8, 9]. Хемотип P. aurantiogriseum var. aurantiogriseum, характеризуется продукцией большого набора вторичных метаболитов. Для большинства изолятов типичными являются такие микотоксины, как пеницилловая кислота, веррикозидин, ксантомегнин, виоксан-тин и виомеллейн, а также аурантин, аурантиа-мин и алкалоиды группы виридикатина [8].
Для изучения алкалоидного профиля культуры BKM F-1298 штамм культивировали глубинным способом на среде Абе. Алкалоиды выделяли из фильтрата культуральной жидкости на 11-е сут роста экстракцией этилацетатом. Суммарный экстракт разделяли колоночной хроматографией на силика-геле в градиенте хлороформ-метанол, содержащий 1% концентрированного водного аммиака. Контроль над процессом осуществляли методом ТСХ в системе I и II. В результате было выделено четыре метаболита, поглощающих в УФ-области спектра.
Обладающий наибольшей хроматографичес-кой подвижностью метаболит 1 (табл. 1) очищали на стеклянной пластинке с силикагелем LSL (Чехия) в системе хлороформ-ацетон 4 : 1. В УФ-спектре этот метаболит имел ряд полос поглощения с Хмакс 228, 269, 279, 310 и 322 нм. Масс-спектр соединения характеризовался молекулярным ионом состава C19H14O2 (измерено 330,1115) и интенсивными фрагментами с m/z 277 и 249, образующимся за счет последовательного выброса ионов C3H3N и CH2N из пиридодиазепиновой части молекулы. Это позволило идентифицировать метаболит как аурантин, выделенный ранее Иеулетом из культуры P. aurantiogriseum IMI 180922 [10, 11]. Аурантин - 6,7,7а,8-тетрагидрохиназоло[3',2':1,6]-пиридо[2,3-в][1, 4]бензодиазепино-9,16-дион, представляет собой бензодиазепиновый алкалоид, в биосинтезе которого принимают участие молекула глутамина и две молекулы антраниловой кислоты (табл. 1). Данный алкалоид обладает ярко выраженным нефротоксическим действием [4].
Следующий по хроматографической подвижности метаболит 2 (табл. 1) очищали перекристаллизацией из этилацетата. В УФ-спектре соединения наблюдали две типичные для многих дикето-пиперизиновых алкалоидов полосы поглощения с ^макс 231, 320 нм [12]. Масс-спектр соединения
Таблица 1. Физико-химические характеристики алкалоидов, выделенных из штамма P. aurantiogriseum var. aurantio-griseum BKM F-1298
Метаболит Хроматографическая подвижность, Rf x 100, на пластинах силуфола в системах Основные характеристические пики в масс-спектре, m/z (%) Структура
I II III
1. Аурантин 47 59 - M+ 330(45), 290(5), 277(100), 249(91), 234(24), 220(16), 192(12), 130(12), 124(16), 102(10) О Н -
2. Аурантиамин 32 38 57 M+ 302(100), 287(21), 260(38), 231(32), 203(78), 188(46), 175(32), 160(48), 133(39), 135(19) о \L- I 1 1 NH 1 О
3. Анацин 18* 27 48 M+
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.