НЕЙРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 1, с. 16-22
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 57.052
АЛЛЕЛЬНЫЕ ВАРИАНТЫ ГЕНА ГАЛАНИНА У КРЫС ВИСТАР © 2014 г. В. И. Людыно*, Т. С. Аксенова, И. Н. Абдурасулова, В. М. Клименко
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины"СЗО РАМН
Представленная работа посвящена анализу модификаций в нуклеотидной последовательности про-моторного региона гена нейропептида галанина у крыс Вистар, являющихся одним из важнейших экспериментальных объектов в медико-биологических исследованиях. Получены доказательства наличия двух аллельных вариантов гена, отличающихся тройной нуклеотидной заменой (аллели АСТ и ОТО). Анализ транскрипционной активности промотора выявил снижение уровня индуцированной экспрессии галанина у гомозиготных носителей аллели ОТО. Частота встречаемости аллели ОТО 0.57, а доля гомозиготных носителей этой аллели в популяции крыс Вистар составила около 28%. Учитывая высокую пластичность экспрессии гена галанина в ответ на травму, ишемию, воспаление и стресс, а также преимущественно протективную роль этого нейропептида при действии повреждающих факторов, животные-носители разных аллельных вариантов гена могут рассматриваться как естественная экспериментальная модель для изучения вклада повышенного/пониженного уровня галанина в механизмы индивидуальной устойчивости.
Ключевые слова: нейропептиды, галанин, аллели, нуклеотидный полиморфизм, экспрессия генов.
Б01: 10.7868/81027813314010105
ВВЕДЕНИЕ
Галанин — нейропептид из 29/30 аминокислот (30 аминокислот содержит галанин человека), экспрессируемый в центральном и периферическом отделах нервной системы. Название этого нейропептида, открытого в 1983 году Виктором Муттом и его коллегами из Каролинского Университета в Стокгольме, происходит от Оконце-вой аминокислоты глицин и С-концевой аминокислоты аланин [1]. За три десятилетия, прошедших со времени идентификации нового пептида, была установлена его колокализация с основными нейромедиаторами — норадреналином, серо-тонином, дофамином, ацетилхолином, ГАМК, глутаматом, а также с нейропептидами — вазо-прессином, субстанцией Р, нейропептидом У и другими [2—4]. Доказано существование трех подтипов рецепторов галанина — Оа1Я1, Оа1Я2 и Оа1Я3; сложилось представление о преимущественно ингибиторном действии галанина на нейроны-мишени [5, 6]. У крысы ген галанина расположен на 1-ой хромосоме. Зрелый пептид образуется в результате ограниченного протеоли-за высокомолекулярного предшественника — препрогаланина, который содержит сигнальный пептид, галанин и пептид длиной 59—60 амино-
*Адресат для корреспонденции: 197376 Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12, тел.: +7 921 337-0549, e-mail: vlioudyno@mail.ru.
кислот на С-конце, названный галанин м-РНК-ассоциированный пептид [7].
Продемонстрирована высокая пластичность экспрессии гена галанина в ряде физиологических и патологических условий. Так, 30-кратного уровня достигает увеличение экспрессии мРНК препрогаланина в ответ на повышение содержания циркулирующих в крови эстрогенов [8, 9]. Значительное увеличение уровня экспрессии мРНК препрогаланина происходит в ответ на ишемию и травму в центральной и периферической нервной системе [10—12]. Повышенное содержание галанина обнаруживается в мозге животных при экспериментально вызванной демие-линизации, а также в посмертных образцах мозга пациентов с рассеянным склерозом и болезнью Альцгеймера [13, 14]. Предполагается, что способность к повышению продукции галанина играет важную роль в адаптации к стрессорным воздействиям [15], так как именно у животных, имевших наименьшую выраженность поведенческих нарушений, отмечался высокий уровень га-ланина в гиппокампе.
Известно, что крысы Вистар являются одним из основных экспериментальных объектов в медико-биологических исследованиях и широко используются для моделирования различных патологических процессов, в том числе, для изучения формирования патологии психоэмоциональной сферы, механизмов нейродегенеративных заболеваний.
Целью представленного исследования была проверка гипотезы о наличии у крыс Вистар структурных изменений в промоторной области гена гала-нина, обуславливающих различия в уровне экспрессии этого нейропептида.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на крысах-самцах породы Вистар (массой 220—260 г), содержавшихся в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде. Первоначально был выполнен анализ нуклеотидной последовательности промотор-ного региона гена галанина для выявления единичных нуклеотидных полиморфизмов. Для этого использовали сочетание метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) и метода конформацион-ного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP — Single Strand Conformation Polymorphism). С помощью метода ПЦР амплифицировали короткие (не более 250 нп) перекрывающиеся участки промо-торного региона гена галанина крысы. Последовательности специфических праймеров приведены в табл. 1.
Полученные ПЦР продукты анализировали методом SSCP, основанном на визуализации различий в электрофоретической подвижности од-ноцепочечных фрагментов ДНК в неденатуриру-ющем геле. Изменение электрофоретического профиля происходит даже при замене одного нуклеотида в цепи ДНК (единичный нуклеотид-ный полиморфизм). Для получения однонитевых фрагментов ДНК использовали ампликоны, синтезированные с помощью метода ПЦР Для этого продукт ПЦР реакции инкубировали 10 мин при 98°С в формамиде в соотношении 1 : 5 (ДНК : формамид). После прогревания пробы немедленно помещали в лед и затем наносили на 9% полиакриламидный гель. Результат SSCP — анализа визуализировали с помощью окрашивания нитритом серебра по стандартной методике и идентифицировали вариабельные участки промотора. Для выявления нуклеотидных замен в вариабельных фрагментах продукты ПЦР реакции очищали с помощью набора для очиски ДНК ("Цитокин", Россия) и се-квенировали на автоматическом секвенаторе ABI 373A (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), используя те же праймеры, что и для постановки ПЦР. Полученные последовательности сравнивали с последовательностью промотора гена галанина крысы (Gene Bank AF 014389.1).
Методом компьютерного анализа для идентифицированных нуклеотидных замен проводили подбор специфических эндонуклеаз рестрикции, и в последующем для определения принадлежности животного к одному из генотипов использовали метод ПЦР с последующим определением полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ).
Таблица 1. Праймеры для амплификации фрагментов промоторной области гена галанина
№ фрагмента Последовательность 5'—3'
1 + праймер tgagctgcaggcccttgcc
— праймер gcgtaaggtctcaggcactgc
2 + праймер agcagtgcctgagaccttacgc
— праймер tggctcacatgtagcagccaa
3 + праймер ttggctgctacatgtgagcca
— праймер agggttctgatcacggctta
4 + праймер agccgtgatcagaaccctcttgg
— праймер ccagggagtttagccaacctgtgc
5 + праймер gggtacctgtatgctgatgtgc
— праймер ctggtccagggtcctaca
6 + праймер atgtaggaccctggacca
— праймер acagagtcacttcccactg
7 + праймер tgactctgtgatgcagggttgg
— праймер tttatacccggtgggagctg
Тотальную ядерную ДНК крыс выделяли по стандартной методике с использованием набора реагентов "сорб Б" ("Петромеддиагностика", Санкт-Петербург). На первом этапе методом ПЦР амплифицировали фрагмент, окружающий область единичного нуклеотидного полиморфизма, и визуализировали полученные фрагменты в 1.5% агарозном геле. На следующем этапе 8 мкл полученного ПЦР-продукта обрабатывали ре-стриктазой Hinf 1 (Fermentos). На основе анализа профилей рестрикции определяли присутствие у животного одного из двух аллельных вариантов гена в гомозиготной или гетерозиготной формах.
Функциональность выявленного нуклеотид-ного полиморфизма оценивали с использованием нерадиоактивного варианта определения изменения электрофоретической подвижности ДНК-белковых комплексов (electrophoretic mobility shift assay, EMSA). Для получения ядерных белковых экстрактов структуры мозга крыс гомогенизировали в буфере А (10 ммоль/л Tris-HCl, 0.32 моль/л сахарозы, 2 ммоль/л MgCl2, 0.1 ммоль/л EDTA, 0.1% Tritón, 0.1 ммоль/л PMSF, 1 ммоль/л DTT) и центрифугировали при 1000 rpm в течение 10 минут. Полученный осадок смешивали с буфером Б (10 ммоль/л Tris-HCl, 25% глицерин, 2 ммоль/л MgCl2, 0.1 ммоль/л EDTA, 0.1 ммоль/л PMSF, 1 ммоль/л DTT, 400 ммоль/л NaCl) и центрифугировали повторно в тех же условиях. Супернатант, содержащий ядерные белки, использовали для определения подвижности ДНК-белковых комплексов по методу EMSA или хранили при —70°C для дальнейшего использования. Короткие олигонуклеотидные последовательности, повторяющие полиморфные участ-
18
ЛЮДЫНО и др.
Рис. 1. Варианты информационных профилей для фрагментов 5'-области (227—493 нп) промотора гена галанина крыс Вистар. Арабскими цифрами пронумерованы дорожки на электрофореграмме. 1, 2, и 4 — полиморфная аллель в гетерозиготном варианте (генотип ACT/GTG); 3 и 6 — полиморфная аллель в гомозиготном состоянии (генотип GTG); 5 и 7 — отсутствие нуклеотидных замен по сравнению с последовательностью Gene Bank AF 014389.1 (генотип ACT).
ки промотора галанина, метили биотином. Реакцию образования ДНК-белковых комплексов проводили, инкубируя 10 мкл ядерного экстракта мозга крысы с 10 нг 5'-биотинилированных дву-цепочечных олигонуклеотидов в связывающем буферном растворе (50 mM HEPES, pH 7.9, 50 mM ZnCl2, 12.5 mM MgCl, 20.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 20% glycerol), содержащем 1 мкг poly (dl : dC) в присутствии 200-кратного избытка немеченых олигонуклеотидных проб. Конечный объем связывающего буфера составлял 20 мкл. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 15 минут. Специфичность ДНК-белковых взаимодействий проверяли в реакции вытеснения с градиентным увеличением концентрации немеченых олигонуклеотидов. Смесь подвергали электрофорезу в 4% полиакриламидном недена-турирующем геле. Для визуализации биотинили-рованных комплексов использовали стрептави-дин-пероксидазный конъюгат и хемилюминес-центный субстрат (Pierce) согласно инструкции производителя. Синтез немеченых и биотинили-рованных олигонуклеотидов выпо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.