АЛЛОСТЕРИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ [3H]ХИНУКЛИДИНИЛБЕНЗИЛАТА МУСКАРИНОВЫМИ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРАМИ МЕМБРАН КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС АДРЕНОТРОПНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ

МАНУХИН Б.Н.; НЕСТЕРОВА Л.А.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2009, том 26, № 2, с. 104-110

УДК 576.314.6.088.6 + 612.11,612.82.015

АЛЛОСТЕРИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ [3И]ХИНУКЛИДИНИЛБЕНЗИЛАТА МУСКАРИНОВЫМИ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРАМИ МЕМБРАН КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС АДРЕНОТРОПНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 26;

электронная почта: manukhinb@mail.ru Поступила в редакцию 04.08.2008 г.

На синаптосомальных мембранах головного мозга крыс исследовано действие адренотропных веществ и мембранотропного агента кокаина на кинетику связывания [3И]хинуклидинилбензилата ([3ЧЮМБ) М-холинорецепторами коры головного мозга крыс. В контроле лучшие результаты получены для модели - два пула рецепторов (высоко- и низкоаффинный) с расчетными параметрами Кй1, Вт1, Кй2, Вт2 и п1 = п2 = 2. Кц = 0.18 ± 0.08 нМ, Вт1 = 221.2 ± 56.7 фмоль/мг белка, КА2 = 1.33 ± 0.11 нМ, Вт2 = 748.7 ± 53.3 фмоль/мг белка. Аллостерическая модуляция активности специфических рецепторов нейротрансмиттеров может осуществляться за счет изменения их аффинности (К), количества (Втах) и соотношения моно- и димерных рецепторов (п). В контроле мускариновые рецепторы представлен^! в виде димеров. На фоне агониста а-адренорецепторов норадреналина и антагониста Р-ад-ренорецепторов пропранолола остается один пул димерных мускариновых рецепторов. Количество мест связывания лиганда снижается примерно на 40 и 20%. Под влиянием агониста а2-адренорецепто-ров клонидина, антагониста а2-адренорецепторов иохимбина и мембранотропного агента кокаина остается один пул рецепторов, но часть димерных рецепторов становятся мономерными (1 < п < 2). Количество мест связывания лиганда (Втах) снижается на 20, 25 и 45% соответственно.

Ключевые слова: М-холинорецепторы, адренорецепторы, [3И]хинуклидинилбензилат.

Физиологическая реакция организма, органа или клетки на изменение внешней или внутренней среды является результатом взаимодействия нескольких регуляторных систем. Взаимодействия могут быть как антагонистическими, так и однонаправленными, и осуществляться на уровнях от ор-ганизменного до клеточного. Так, клонидин инги-бирует выделение ацетилхолина в трахее морской свинки [1]. М2-холинорецепторы принимают участие в регуляции Р-адренергического ответа гладкой мускулатуры дыхательных путей кролика [2]. Агонист а1-адренорецепторов метоксамин, антагонист М-холинорецепторов атропин и мембрано-тропный агент кокаин модулируют связывание [3И]дигидроалпренолола Р-адренорецепторами на-тивных эритроцитов крыс [3]. Установлено также изменение а-адренергической реакции при блокаде Р-рецепторов, Р-адренергической реакции при блокаде а-адренорецепторов и холинергической реакции при активации и блокаде а-адренорецепторов воротной вены печени крысы [4].

Представленные данные показывают возможность взаимодействия нейротрансмиттерных систем, выявляемого в физиологических и радиоли-гандных экспериментах. В физиологических реакциях взаимодействие может осуществляться как

на рецепторном, так и пострецепторном внутриклеточном уровне. Для радиолигандных экспериментов более вероятно взаимодействие на уровне рецепторов.

Задачей работы было изучение влияния агони-стов и антагонистов адренорецепторов и, для сравнения, мембранотропного агента кокаина на параметры кинетики связывания специфического антагониста [3Н]хинуклидинилбензилата ([3H]QNB) мускариновыми холинорецепторами мембран коры головного мозга крыс.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Мембраны коры головного мозга крыс выделяли по методу S.W. Henn и F.A. Henn [5] с некоторыми модификациями [6]. Готовые мембранные препараты хранили при -70°С в течение 3 недель. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [7], в качестве стандарта брали бычий сывороточный альбумин ("Sigma", США).

Для активации и блокады адренергических рецепторов использовали неселективные агонисты и антагонисты адренорецепторов: норадреналин -агонист а-адренорецепторов, клонидин - агонист

ог-адренорецепторов, иохимбин - антагонист а^ад-ренорецепторов, пропранолол - антагонист Р-ад-ренорецепторов (все вещества фирмы "Sigma", США) и, для сравнения, кокаин - мембранотроп-ный агент. Радиолигандный анализ проводили по описанному ранее методу [8]. Объем инкубационной среды составлял 100 мкл - 50 мкл суспензии мембран, 50 мкл буфера трис-HCl 50 мМ, pH 7.4, вытеснитель (атропин) и радиоактивный лиганд [3H]QNB (L -хинуклидинил-[фенил-4-3Н]-бензилат, "Amersham", Англия, 41.5 Ки/моль) в конечных концентрациях 0.3-9.0 нМ для [3H]QNB, 10 мкМ для адренотропных агентов и кокаина. Вещества вводили в инкубационную среду за 20 мин перед добавлением [3H]QNB. Смесь инкубировали в течение 30 мин при 22°С. Реакцию связывания останавливали добавлением 1 мл холодного буфера (0°С). Специфическое связывание определяли по разнице между общим связыванием лиганда и в присутствии 10 мкМ атропина ("Sigma", США).

Связывание радиоактивных антагонистов со специфическими адрено- и холинорецепторами изолированных мембран коры мозга крыс описывается уравнениями для одного или двух пулов рецепторов [9]:

b = [(BmaxAn)/( K"dl + A")], (1)

b = [(Bm!An1)/( Knd1 + A"1)] + [(Bm2An2)/( Kf2 + An2)], (2)

где b - количество связанного лиганда, Bm1 и Bm2 (Bm1 + Bm2 = Bmax) - количество мест связывания лиганда в высоко- и низкоаффинном пулах рецепторов в единой эффекторной системе с константами диссоциации Kd1 и Kd2 и коэффициентами nb n2, A -концентрация лиганда в среде. Исходя из этих уравнений, действие каждого из исследованных веществ анализировали с использованием ранее семи [9], а в этой работе девяти математических и графических моделей лиганд-рецепторного взаимодействия.

Модели: I - один пул рецепторов с рассчитанными параметрами Bmax, Kd и заданной величиной n = 1; II - один пул рецепторов с рассчитанными параметрами Bmax, Kd и заданной величиной n = 2; III -один пул рецепторов с рассчитанными параметрами Bmax, Kd, n; IV - два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Bm1, Kd1, и Bm2, Kd2 и заданной величиной n1 = n2 = 1; V - два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Bm1, Kd1, n1 и Bm2, Kd2, n2 (n1 = n2); VI - два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Bm1, Kd1, и Bm2, Kd2, и заданной величиной n1 = n2 = 2; VII - два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Bm1, Kd1, n1 и Bm2, Kd2, n2 (n1 Ф n2). VIII - два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Bm1, Bm2, Kd1 = Kd2 и заданными величинами n1 = 1 и n2 = 2; IX - два пула рецепторов с рассчитанными параметрами Bm1, Bm2, Kd1 = Kd2, n1 = n2. Теоретически возможны и другие более

сложные модели лиганд-рецепторного связывания, но их применение пока не давало удовлетворительных результатов.

Расчет основных параметров лиганд-рецепторного взаимодействия - Kd1, Kd2, Bm1, Bm2, n1 и n2 -проводили с помощью компьютерной программы "SigmaPlot" по уравнениям (1) и (2). Эффективность связывания лигандов с различными пулами рецепторов (E) определяется выражением:

E = Bmax/2Kd. (3)

Эффективность (E) является интегральным показателем, характеризующим величину связывания лиганда при его концентрации, равной Kd (фмоль/мг белка/нМ) [9].

В опытах было по 7-11 экспериментальных точек, каждая с трехкратным повтором. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюден-та (p < 0.05). Все значения представлены как среднее арифметическое и стандартная ошибка среднего (M ± SEM).

РУЗУЛЬТАТЫ

В контроле по величине ошибок среднего для каждого параметра и стандартной ошибки расчетов (Standard Error of the Estimate - показывает величину стандартной ошибки различия между экспериментальными и теоретическими кривыми) лучшие результаты получены для модели - два пула рецепторов (высоко- и низкоаффинный) с расчетными параметрами Bm1, Kd1, и Bm2, Kd2, и величиной n1 = n2 = 2, что соответствует уравнению (2) (модель VI). В контроле Kd1 = 0.18 ± 0.08 нМ, Kd2 = = 1.33 ± 0.11 нМ, Bm1 = 221.2 ± 56.7 фмоль/мг белка, Bm2 = 748.7 ± 53.3 фмоль/мг белка, n = 2, E1 = 614.4 ± ± 55 фмоль/мг белка/нМ, E2 = 281.5 ± 50 фмоль/мг белка нМ (табл. 1).

Все исследованные биологически активные вещества вызвали существенные изменения в характере связывания [3H]QNB мембранами коры головного мозга крыс. Общим является исчезновение высокоаффинного пула рецепторов. Величина Kd возрастает и приближается к Kd2 контроля. Снижается количество активных рецепторов, также преимущественно за счет высокоаффинного пула (Bm1). Однако есть определенные различия в действии каждого вещества.

На фоне норадреналина (табл. 1) наименьшие ошибки в величине параметров и ошибки вычислений получены при расчете по уравнению (1) (модель II), т.е. изменяются не только параметры, но и характер связывания лиганда. Определяется только один пул рецепторов, почти в 2 раза меньший, чем в контроле. Величина Kd в 3 раза больше, чем Kd1, и в 2 раза меньше, чем Kd2. Эффективность (E) при этом снизилась почти в 2 раза по сравнению с контролем (табл. 1). Антагонист ß-адрено-

Таблица 1. Влияние адренотропных веществ и кокаина на связывание [3И]хинуклидинилбензилата мускарино-выми холинорецепторами мембран коры головного мозга крыс

Параметры Контроль Норадреналин Пропранолол Клонидин Иохимбин Кокаин

Kdi 0.18 ± 0.08 — — — — —

Kd2 1.33 ± 0.11 0.63 ± 0.03 1.06 ± 0.04 0.98 ± 0.04 0.89 0.07 0.94 ± 0.08

Wi 2 — — — — —

«2 2 2 2 1.69 ± 0.04 1.58 ± 0.17 1.45 ± 0.15

Bi 221 ± 57 — — 186 ± 67 264 ± 98 264 ± 61

B2 749 ± 53 562 ± 9 767 ± 12 585 ± 59 465 ± 88 280 ± 54

Ei 614 ± 57 — — 95 ± 67 148 ± 98 140 ± 61

E2 282 ± 53 446 ± 9 362 ± 12 298 ± 59 261 ± 88 148 ± 54

Ошибка вычисления* 16.9 14.8 16.8 15.9 23.2 13.9

Модель VI B2K22 II B1K12 II B1K12 IX B2K1« IX B2K1« IX B2K1«

* Standard Error of the Estimate - квадратный корень суммы квадратов отклонений экспериментальных точек от расчетных величин.

Примечание. Kd2 — константы диссоциации высоко- и низкоаффинного пулов рецепторов; Bmj, Bm2 — концентрация М-холинорецепторов высоко- и низкоаффинного пулов, «1 и «2 — показатель степени для концентрации лиганда в уравнениях (1) и (2). Ej и E2 — эффективность высоко- и низкоаффинного пулов рецепторов.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.