АЛЛОСТЕРИЧЕСКОЕ ВЛИЯНИЕ СЕРОТОНИНА И МИАНСЕРИНА НА КИНЕТИКУ СВЯЗЫВАНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ [3H]-ЛИГАНДОВ АДРЕНЕРГИЧЕСКИМИ И МУСКАРИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ В МЕМБРАНАХ КЛЕТОК КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

МАНУХИН Б.Н.; НЕСТЕРОВА Л.А.

ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2015, № 2, с. 169-179

ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ ^^^^^^^^^^^^ И ЧЕЛОВЕКА

УДК 576.314.6.088.6+612.11,612.82.015

АЛЛОСТЕРИЧЕСКОЕ ВЛИЯНИЕ СЕРОТОНИНА И МИАНСЕРИНА НА КИНЕТИКУ СВЯЗЫВАНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ [3Щ-ЛИГАНДОВ АДРЕНЕРГИЧЕСКИМИ И МУСКАРИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ В МЕМБРАНАХ КЛЕТОК КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119443 Москва, ул Вавилова, 26

E-mail: nesterovala@idbras.ru Поступила в редакцию 16.07.2014 г.

Изучено влияние активации (серотонином) и ингибирования (миансерином) серотониновых рецепторов на свойства ai-, а2-адренорецепторов и мускариновых холинорецепторов субклеточных фракций мембран из клеток коры головного мозга крыс. Экспериментальные данные кинетики связывания специфических антагонистов адренергическими и мускариновыми рецепторами, проанализированные с помощью графических и математических методов, свидетельствуют о наличии аллостерического (cross-talk) взаимодействия. В контроле ai- и а2-адренорецепторы представлены одним, а мускариновые — двумя пулами. На фоне серотонина выявлены два пула адренорецепторов с различной аффинностью. Установлено, что миансерин вызывает образование двух пулов только а2-рецепторов, а мускариновые рецепторы в контроле и опыте представлены двумя пулами, различающимися по значениям основных параметров — константы диссоциации и концентрации адренорецепторов. Показано, что аллостерическое влияние серотонина и миансерина проявляется в ингибировании мускариновых рецепторов. Предполагается существование адрено- и холинорецепторов в виде димеров. Взаимодействие между адренергической, холинергической и серотонинерги-ческой системами, вероятно, реализуется на уровне клеточной мембраны.

DOI: 10.7868/S0002332915020058

В регуляторных системах организма одновременно действуют нейротрансмиттеры, гормоны и другие биологически активные вещества. Эти регуляторы не только влияют на специфические рецепторы, но и могут аллостерически модулировать (cross-talk) активность других эффекторных систем. В частности, показана функциональная взаимосвязь между серотонинергической, холинергической и адренергической системами. Се-ротонин (5-гидрокситриптамин, 5-HT) — один из основных нейромедиаторов, участвующих во многих процессах в центральной нервной системе, включая поведение, агрессию, восприятие боли и тревоги. На периферии 5-HT регулирует активность вегетативной нервной системы, сердечно-сосудистую деятельность, агрегацию тромбоцитов, рост гладких мышц, работу желудочно-кишечного тракта и т.д. (Ramage, Villalon, 2008). 5-HT, активируя пресинаптические 5-HT3- и 5-НТ4-ре-цепторы в дыхательных путях человека, модулирует сократительную холинергическую реакцию (Dupont et al., 1999). Обезболивающий эффект 5-HT2-агонистов обусловлен выделением ацетил-холина в спинальных нейронах (Obata et al., 2003). Антагонист 5-HT миансерин проявляет антиму-скариновую активность по отношению к преси-

наптическим (Kwok, Mitchelson, 1982) и увеличивает аффинность постсинаптических мускариновых рецепторов (М-ХР) (Carlson et al., 2003). На срезах гиппокампа 5-HT конкурентно снижает вызванную карбахолом ритмическую активность (Matsumoto et al., 2001). 5-HT модулирует когнитивные (Rashid et al., 2003) и связанные с памятью процессы, в которых участвует холинергическая нервная система (Birthelmer et al., 2003). Антагонисты 5-HT-рецепторов ингибируют связывание L-хинуклидинил-[фенил-4-3H]бензилат ([3H]-QNB) мембранами миокарда крысы. При этом по активности некоторые из них сопоставимы со специфическими антагонистами мускариновых рецепторов (Matsumoto et al., 2001).

Адренергическая и серотониновая системы реципрокно взаимодействуют на уровне клеток. Так, ингибиторы обратного захвата 5-HT снижают транспорт норадреналина в нейроны (Blier, Szabo, 2005). Неселективный блокатор Р-адрено-рецепторов басиндолол активирует 5-HT-рецеп-торы кардиоваскулярной системы и ингибирует а1-адренорецепторы (АР) (Watts et al., 2000). Антагонист 5-HT-рецепторов миансерин увеличивает диастолическое давление, которое регулируется а-адренорецепторами (Kalkman et al., 1983).

Лиганды 1,3-диоксолановой структуры могут связываться с а1-АР и 5-НТ(1А)-рецепторами (Sorbi et al., 2009). 5-НТ изменяет параметры связывания [3H]-RX821002 с а2-АР в мембранах коры головного мозга цыплят (Diez-Alarcia et al., 2006). [3H]-8-OH-DPAT - лиганд 5-НТ(1А/7)-ре-цепторов — также связывается с а2-АР мозга мышей (Bonaventure et al., 2004).

Приведенные данные свидетельствуют о существовании взаимодействия серотонинергиче-ской, холинергической и адренергической ней-ротрансмиттерных систем. Для радиолигандных экспериментов оно более вероятно на уровне мембраны клетки. Можно предположить, что присоединение нейротрансмиттера к своему рецептору аллостерически изменяет активность других рецепторов, модулируя физиологические и биохимические реакции клеток.

Цель работы — изучение действия 5-НТ и антагониста серотониновых рецепторов миансерина на кинетику связывания специфических антагонистов [3Н]-празозина, [3H]-RX821002 аг, а2-ад-ренорецепторами и [3H]-QNB мускариновыми холинорецепторами в мембранах клеток коры головного мозга крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опыты проводили на клеточных мембранах коры головного мозга крыс-самцов линии Вистар (210—250 г, 65 крыс), которые выделяли методом Хенн С.В. и Хенн Ф.А. (Henn, Henn, 1982). Готовые мембранные препараты хранили при —70°С в течение трех недель. Концентрацию белка определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951); в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (Sigma, США). Несвязанный ли-ганд отмывали с мембран на стекловолокнистых фильтрах GF/B (Whatman, Великобритания). Объем инкубационной среды составлял 100 мкл: 50 мкл суспензии мембран, в опыте вносили аго-нист или антагонист серотониновых рецепторов (серотонин или миансерин, Sigma) в концентрации 10 мкМ (10 мкл) и радиоактивный лиганд, а в контроле — нерадиоактивный вытеснитель ли-ганда. Буфером Tris-HCl 50 мМ, pH 7.4, инкубационную среду доводили до стандартного объема. Реакцию останавливали добавлением 1 мл холодного буфера (0°С). Параметры связывания лиган-дов определяли с использованием специфических неселективных антагонистов: а1-АР — [3Н]-празозина (77 Ки/мМ) в концентрациях 0.33— 14.85 нМ, а2-АР — [3H]-RX821002 (77 Ки/мМ) в концентрациях 0.33—6.6 нМ и М-ХР — L-хинук-лидинил-[фенил-4-3Н]бензилат (41.5 Ки/мМ) в концентрациях 0.3—4.95 нМ. Специфическое связывание радиоактивного лиганда оценивали

по разнице между общим и неспецифическим связыванием в присутствии нерадиоактивных антагонистов — празозина, раувольфсцина и атропина (Sigma) в концентрациях 10 мкМ. Вещества вводили в инкубационную среду за 20 мин до добавления радиоактивного лиганда. Реакцию связывания лиганда с рецепторами проводили в течение 30 мин при 22°С. Общее время инкубации составило 50 мин.

Взаимодействие а1-, а2-АР и М-ХР изолированных мембран коры головного мозга крыс со специфическим радиоактивным антагонистом описывается уравнениями для одного или двух пулов рецепторов (Manukhin et al., 1999). Основные параметры лиганд-рецепторного взаимодействия (Kd, Bmax, Kdi, Kd2, Bmi, Д„2, и пь n2) рассчитывали с помощью компьютерной программы:

b = [(BmaxAn)/(K"d + An)], (1)

b = [(Bm1 An1)/(Kd1 + An1)]+ [(Bm2An2)/(K d2 + An2)], (2)

где b — количество связанного лиганда; Bmax — количество рецепторов в 1 мг белка с константой диссоциации Kd; Bm1 и Bm2 — количества рецепторов в 1 мг белка в высоко- и низкоаффинном пулах рецепторов в одной эффекторной системе (Bmax = Bm1 + Bm2) с константами диссоциации Kd1 и Kd2 и коэффициентами кооперативности (Хил-ла) п1 и п 2 соответственно; [A] — концентрация ли-ганда в среде. Характер ингибиторного действия серотонина и миансерина на связывание лиган-дов а1-, а2-АР и М-ХР оценивали по изменению количества и аффинности активных рецепторов (Bmax и Kd) (Диксон, Уэбб, 1982).

Эффективность связывания (Е) лиганда с рецепторами определяли по уравнению

E = Bmax/2Kd, (3)

где Е — интегральный показатель, количественно характеризующий связывание лиганда при его концентрации, равной Kd ((фмоль/мг белка)/нМ).

В опытах было по 7—9 точек, каждая с трехкратным повтором. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (р < 0.05). Все значения представлены как средние арифметические и стандартные ошибки средней (M ± SEM). Дополнительно наглядную информацию о закономерностях лиганд-рецепторного взаимодействия дает графический анализ экспериментальных данных с помощью линеаризированных по Скетчарду уравнений (1) и (2):

(b/An) = [(Bmax)/(Kd)] - [b/(K d)], (4)

(b/An)=[(Bm1+Bm2)/(Kd1 + Kd1)] - [b/(Kd1 + Kd1)]. (5)

Действие веществ анализировали с использованием 10 математических моделей связывания лиганда рецептором (Manukhin et al., 1999; Ману-

b, фмоль/мг белка 40

30 -

20 -

10

8 12 16 A, [3H] празозин, нМ

Рис. 1. Влияние серотонина и миансерина на связывание [3Н]-празозина а^-адренорецепторами мембран коры головного мозга крыс. А — концентрация лиганда, b — количество рецепторов в 1 мг белка. 1 — контроль, 2 — серотонин, 3 — миансерин; для рис. 1— 7. Параметры связывания [3Н]-празозина а^-адреноре-цепторами: в контрольном опыте Kd = 1.53 ± 0.01 нМ, Bmax = 31.6 ± 0.1 фмоль/мг белка, n = 2; на фоне серотонина Kd1 = 0.69 ± 0.09 нМ, Kd2 = 4.1 ± 0.2, нМ, Bm1 = = 7.9 ± 0.9 фмоль/мг белка, Bm2 = 24.9 ± 0.8 фмоль/мг белка n = 2; на фоне миансерина Kd1=3.94 ± 0.01 нМ,

Bm

: 35.5 ± 0.1 фмоль/мг белка, n = 2.

хин, Нестерова, 2009). На графиках представлены результаты одного опыта. Экспериментальные точки нанесены на теоретические кривые. Их совпадение демонстрирует адекватность математических расчетов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Серотонин и миансерин — модуляторы активности а1-адренорецепторов мембран клеток коры головного мозга крыс. На рис. 1—3 приведены экспериментальные точки и теоретические кривые, рассчитанные по конкретным результатам одного из экспериментов. В контрольных опытах графики специфического связывания [3Н]-празозина с а1-АР изолированн

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.